選題策劃 | 劉威（浙江農林大學，博士）

撰稿 | 王凌（歐洲分子生物學實驗室，研究員）

說明 | 本文由論文作者（課題組）撰稿

自熒光蛋白發(fā)現(xiàn)以來，用熒光標記技術對神經細胞的鈣離子進行動態(tài)光學顯微成像是神經領域科學家研究大腦功能最主要和最直觀的手段之一。

因哺乳動物腦組織固有的光散射特征，對活體小鼠進行一定深度和視場的非侵入式（或微損）神經細胞成像目前主要依賴于雙光子顯微鏡。雙光子成像技術所具有的非線性特性可以在無共聚焦條件下，實現(xiàn)高分辨的結構和功能成像。然而，為了實現(xiàn)更大深度的成像需要增加激光功率，這樣會在組織表層產生熒光信號，導致圖像的背景噪聲增加。因此，一般情況下小鼠腦組織的非侵入式雙光子成像深度被限制在1毫米以內，即通常所說的腦皮層成像。

三光子成像技術利用了更高階的非線性效應，除了表層組織的背景噪聲更小之外，由于采用了更長波長的光子來激發(fā)熒光信號，生物組織對激發(fā)光的散射減弱，可以實現(xiàn)更大的穿透深度。之前的研究表明，三光子顯微鏡可以獲得超過1mm深度的腦組織圖像。與雙光子成像技術一樣，在大深度生物組織成像時，三光子技術同樣面臨樣品不均一性引起的光學像差。深度增加，像差也隨之增加。再疊加其他不利因素，常規(guī)的光學技術難以將激光完全聚焦于深層組織中的精細結構上來獲得高解析度的圖像。

圖1：用于調制光場的變形鏡?？梢园阉麄兛醋魇悄茈S意變形的哈哈鏡。多虧了這面鏡子，可以看到大腦深處神經元細胞的清晰圖像。

鑒于此，9月30日，歐洲分子生物學實驗室（EMBL）與德國海德堡大學共同完成，以“High-resolution structural and functional deep brain imaging using adaptive optics three-photon microscopy”為題在 Nature Methods 報道了一項自適應光學三光子成像顯微技術，這一開創(chuàng)性技術將使科學家能夠以前所未有的高分辨率捕捉大腦深部神經元的精細細節(jié)。

自適應光學最初用于天文學中對天體的觀察，利用一個變形鏡來補償大氣的光學像差，以獲得更清晰的圖像。在顯微鏡中，研究人員采用類似的方法對組織本身的光學像差進行預補償，實現(xiàn)對激發(fā)光的更高效聚焦（圖2）。

圖2 自適應光學顯微鏡原理

不同之處在于，這個補償需要在激光進入樣品組織之前進行，類似于把變形鏡放置于大氣層之外。研究團隊展示了活體小鼠大腦組織高達1.4mm深度的高分辨三維圖像（圖3），首次實現(xiàn)了無損狀態(tài)下海馬（大腦中負責記憶）區(qū)域中神經元的樹突與軸突的高分辨成像，以及纖維狀星形膠質細胞的動態(tài)功能成像。

圖3 小鼠腦皮層和海馬區(qū)域的三維圖像，青色與綠色分別為三次諧波圖像和綠色熒光蛋白標記的神經細胞圖像。

這是一項飛躍性的，更先進的，非侵入式的，研究活體組織的顯微成像技術。除了研究腦組織，該技術也可以應用于他生物體組織。顯而易見，該技術將為基于動物實驗的疾病和生理學研究擴展出更大的空間。

論文信息：

Streich, L., Boffi, J.C., Wang, L. et al. High-resolution structural and functional deep brain imaging using adaptive optics three-photon microscopy. Nat Methods 18, 1253–1258 (2021). 

該課題由EMBL的Robert Prevedel博士領導，博士生Lina Streich為論文第一作者，合作團隊包括海德堡大學的Amit Agarwal課題組，以及同樣來自EMBL的Cornelius T. Gross課題組。

論文地址：

https://doi.org/10.1038/s41592-021-01257-6

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監(jiān)制 | 趙陽

編輯 | 趙唯

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