【BioArt按】

9月15日，基因組學(xué)一流期刊《Genome Biology》（IF：11.313）在線發(fā)表了來自南京大學(xué)的一項關(guān)于新型基因編輯技術(shù)的突破性成果。該文的通訊作者分別是南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院的周國華教授、南京大學(xué)模式動物研究所趙慶順教授和朱敏生教授。同期，《Genome Biology》配發(fā)評論文章“DNA-guided genome editing using structure-guided endonucleases”。近幾年來，基因編輯的發(fā)展一路高歌猛進(jìn)，特別是今年5月河北科大韓春雨在《Nature Biotechnology》報道的有關(guān)NgAgo的爭議論文橫空出世更是讓很多國內(nèi)普通老板姓都開始慢慢了解基因編輯了。今天BioArt不再討論NgAgo的重復(fù)性問題，讓我們把目光轉(zhuǎn)向南京大學(xué)近日發(fā)表的這一突破性成果。BioArt有幸邀請到基因編輯技術(shù)的實踐者儀宏老師和蔣威博士特別撰寫了一篇評論性文章，題為《源于天然，超越天然——南京大學(xué)周國華教授DNA編輯論文讀后感》。

2016年9月15日，《Genome Biology》報道了一種基于SGN的基因編輯新技術(shù)，以結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的內(nèi)切酶（SGN，Structure-guided nuclease）實現(xiàn)體內(nèi)外DNA任意序列的靶向和切割。論文一作為Shu Xu，論文通信作者為南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院的周國華（Guohua Zhou）研究員、南京大學(xué)模式動物研究所的趙慶順（Qingshun Zhao）教授和朱敏生（Minsheng Zhu）教授。做為基因編輯領(lǐng)域的從業(yè)者，讀后很有感觸，應(yīng)BioArt主編之邀請，以半學(xué)術(shù)的方式、以隨筆的形式寫出，與各位分享，不嚴(yán)謹(jǐn)之處請大家各自消毒。

感觸之一：構(gòu)思巧妙，略有瑕疵，瑕不掩瑜。

論文中，作者巧妙地融合FEN1（Flap endonuclease-1，是一種可以特異性識別flap結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶，參與DNA的復(fù)制，修復(fù)和重組過程；除此之外它還具有雙鏈DNA特異的5‘-3’的核酸外切酶活性）和已經(jīng)被成功用于ZFN和TALEN的DNA剪切結(jié)構(gòu)域Fok I，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化的linker（GS repeats），設(shè)計了一個chimeric protein，實現(xiàn)了可編程的基因編輯系統(tǒng)，具有以下特點：短鏈ssDNA導(dǎo)向的基因組特定位置；編輯結(jié)果是產(chǎn)生大片段的deletion（可以大于2.6kb）；可以在斑馬魚胚胎中成功編輯內(nèi)源基因。這個構(gòu)思，看得出包含ZNF以及TALEN的影子，其實這三者設(shè)計思路是一致的，其創(chuàng)新點在于靶向元件的選擇十分巧妙，切割元件直接me too。令人驚喜的是，這種原創(chuàng)性工作出自我們中國科學(xué)家團(tuán)隊，略有遺憾的是，論文中體內(nèi)靶點做的偏少，也沒有以CRISPR或者TALEN為對照，導(dǎo)致尚不能夠評估其相對低的編輯效率是來自位點特異性障礙還是來自技術(shù)本身（znf703基因編輯效率1/96≈1%；cyp26b1基因編輯效率是3/29≈10%、這個位點還真不低）。另外一點，如果SGN系統(tǒng)編輯結(jié)果是產(chǎn)生大片段的deletion，那么后期的同源重組做起來要相對困難（冒昧的揣測一下：FEN-1外切酶活性是否可以dead？貌似大片段的deletion應(yīng)該是5'-3'的核酸外切酶活性引起的）。

感觸之二：表述質(zhì)樸謙遜，留下很大的優(yōu)化空間。

通篇論文讀下來，科學(xué)之外，還感覺到一種相對質(zhì)樸的文風(fēng)，措辭之間充盈著謙遜。這么講，可能超出了學(xué)術(shù)范疇，所以稱之為隨筆，既然自己給自己開了這么一個后門，所以，干脆就談出來，好在筆者與南京大學(xué)與作者沒有關(guān)聯(lián)，也就沒有了套磁之嫌疑。例如，在基本術(shù)語上作者沒有跟風(fēng)：“SGN”而不是“ssDNA guided Nuclease”，“DNA editing”而不是“genome editing”，這些細(xì)節(jié)都能夠體現(xiàn)出一種“獨立性”?；蚓庉嫾夹g(shù)的效率是極其重要的，目前看在這篇論文中，作者沒有更多地報道相關(guān)的條件優(yōu)化工作，例如效率瓶頸是存在于guide DNA與靶向區(qū)域的結(jié)合效率？還是存在于SGN的識別效率？整個生物學(xué)場景之中，目標(biāo)區(qū)域的DNA melting究竟有多重要？是轉(zhuǎn)錄相關(guān)事件還是復(fù)制相關(guān)事件？（冒昧的揣測一下：是不是質(zhì)粒編輯實驗中采用可誘導(dǎo)啟動子即可幫助判斷？）當(dāng)然，不應(yīng)該要求一篇論文解決和回答這么多的科學(xué)或技術(shù)問題，但是可以預(yù)計，這個新工具可能還有較大優(yōu)化空間，期待著他們更多的進(jìn)一步報道。

感觸之三：就是要挑戰(zhàn)CRISPR，盡管它似乎難以逾越！

眾所周知，今年5月2日《Nature Biotechnology》在線發(fā)表河北科技大學(xué)韓春雨博士“一鳴驚人”的論文，報告了一種NgAgo-gDNA基因編輯新工具，盡管因不可重復(fù)而使韓春雨“一波三折”地陷入學(xué)術(shù)誠信危機(jī)，但是，此文也算是高調(diào)地揭開了挑戰(zhàn)CRISPR暗中競賽的蓋子。盡管CRISPR如日中天，甚至有“l(fā)ong live CRISPR”之類的戲言，但是，CRISPR并不完美，這種“不完美”不僅僅來自O(shè)ff-target、PAM的限制性、難以實現(xiàn)單堿基精確編輯之類的技術(shù)瑕疵，更是來自人類對新技術(shù)的“天然貪婪”，來自根深蒂固的奧林匹克精神“更快、更高、更遠(yuǎn)”，來自我們骨子里的征服欲。正如哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教授George Church所言：新技術(shù)都是脆弱的，隨時可能被取代；加州大學(xué)圣迭戈分校的Prashant Mali 說的更直白“我們需要的不止這些”。所以，從技術(shù)使用者的角度看，CRISPR是大自然和幾位先鋒科學(xué)家送來的珍貴禮物，在欣然擁抱它的同時、當(dāng)然也期待著更好的技術(shù)出現(xiàn)；從技術(shù)開發(fā)者的角度看，大紅大紫般火熱的CRISPR又是新的競賽標(biāo)桿，它令人嫉妒地、高傲地立在那里，挑逗和激發(fā)著人們超越它的沖動。

感觸之四：源自天然、超越天然，從基因編輯技術(shù)演化史看“工程化”在技術(shù)工具開發(fā)中的重要性。

有人把基因編輯技術(shù)做了“斷代工程”，給技術(shù)劃代，很形象、也利于普及，但是有時候也比較困難。一般地，理論上可以在哺乳動物細(xì)胞中近乎任意位點切割并引發(fā)編輯的ZFN、TALEN以及CRISPR，它們在時間節(jié)點上依次出現(xiàn)、而且效率和便利性也越來越好，所以被稱為第一代、第二代、第三代基因編輯技術(shù)（1G、2G、3G）。筆者愿意把他們稱之為大眾基因編輯工具，因為對應(yīng)著的還有一些小眾工具，鑒于其自身的技術(shù)局限和缺陷，并沒有被大家普遍接受。今天，先聊一聊大眾工具，隨后加一些小花邊，再聊聊那些正在被淘汰和被遺忘的小眾工具，補(bǔ)充這些小眾工具的演化史，可以更加清晰地看出技術(shù)發(fā)展脈絡(luò)，或許從中獲得另外的靈感和啟發(fā)。

從大眾工具看，“工程化”貫穿始終?，F(xiàn)代中文語境中，一直有一種混淆科學(xué)與技術(shù)的“語義學(xué)”困境?？茖W(xué)與技術(shù)相關(guān)但不相同，有人形象地這樣區(qū)分科學(xué)與技術(shù)：know what，know why是科學(xué)，know how是技術(shù)。基因編輯總體上是一種技術(shù)，其相關(guān)工具的開發(fā)，起步于科學(xué)發(fā)現(xiàn)，但是不止步于科學(xué)發(fā)現(xiàn)。例如，從現(xiàn)有公開文獻(xiàn)看，CRISPR最重要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)節(jié)點是2011年卡彭蒂艾（Emmanuelle Charpentier）對tracrRNA的生物學(xué)功能的闡明。但是，有時候，造物主很懶，他開辟了這個世界之隨后可能置之不理了。所以，大自然留給我們的禮物，有時候配不上我們征服的野心，因此，就人類目標(biāo)而言，我們從來都不吝嗇和遲疑于改進(jìn)和再造。果然，隨后的2012年，卡彭蒂艾就會同詹妮弗·刀娜（Jennifer A. Doudna）聯(lián)合發(fā)表了劃時代論文，把tracrRNA和guide RNA合二為一，做成了工程化的“chimeric single guide”，sgRNA由此誕生。而在CRISPR-Cas工程化、模塊化方面貢獻(xiàn)最大的，應(yīng)該首推華人科學(xué)家張鋒教授。除CRISPRi、 CRISPRa之外，早在2013年的綜述中，張鋒教授就展望了包括把Cas設(shè)計為光控模式在內(nèi)的各類工程化方案。而就是在本月，又推出了兩項以遙控sgRNA的方式對CRISPR實施即時控制的技術(shù)方案。哈佛和神戶大學(xué)的團(tuán)隊先后發(fā)表了利用“工程化”措施將AID與dCas9做成chimeric protein實現(xiàn)了不依賴于同源重組的單堿基編輯。就在本月初，MIT的團(tuán)隊創(chuàng)建了光敏感的sgRNA技術(shù)；幾乎與此同時，深圳的科學(xué)家團(tuán)隊報告了“化學(xué)控制”的sgRNA的控制技術(shù)。

讓我們把視野再回望到ZFN和TALEN，更是工程化的杰出案例，直至今天討論的SGN，其“動作模塊”甚至“毫不動搖”地使用FokⅠ，所變換進(jìn)化的是“GPS定位模塊”。這堪稱技術(shù)演化之中還留下了歷史痕跡，好似“保守序列”一樣，讓人驚嘆“自然進(jìn)化”與“人工進(jìn)化”異曲同工之奇妙。

所以，基因編輯工具開發(fā)工程化的基本方程式是：GPS定位模塊+執(zhí)行模塊。話分兩頭說。

先聊“執(zhí)行模塊”。FokⅠ屢戰(zhàn)屢勝，但是，一定還有其它選擇，畢竟，造物主應(yīng)該是慷慨的，地球生命演化了四十億年，留下的自然遺產(chǎn)極為豐富。

再聊聊GPS定位模塊。這個模塊工作效率及操作便利性如何，是基因編輯工具“好不好使”的關(guān)鍵。ZFN和TALEN的主要特點是：以蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)域來完成靶向定位，其主要缺陷是：定位模塊體外準(zhǔn)備麻煩，工作量大成本高；相比之下，CRISPR-Cas卻方便的多，所以在總體競爭中勝出。但是CRISPR-Cas還是或多或少存在Off-target的弊端，為了解決這個問題、進(jìn)一步強(qiáng)化定位精準(zhǔn)性，已有報道以dcas9為定位器，融合上FokⅠ，實現(xiàn)正義鏈和反義鏈雙向定位、并形成FokⅠ二聚體造成DNA雙鏈斷裂（DSB）、引發(fā)編輯。本次討論的南京大學(xué)的這篇文章，再一次創(chuàng)新了GPS定位模塊，首次采用FEN-1（flap endonuclease-1）來執(zhí)行定位功能，將定位指令轉(zhuǎn)化為方便人工編程的guide-ssDNA，做的很巧妙。

聊到這里，下一個創(chuàng)新近似于呼之欲出：盡管NgAgo似乎失敗了，但是它工程化改造的前景呢？pAgo做為基因組“GPS定位模塊”的可能性，怎能不令工具開發(fā)者怦然心動，就連我那個簡陋的實驗室，都已經(jīng)于幾個月前就開始努力了，萬一大牛們漏掉了某些創(chuàng)意呢？

總之，GPS定位模塊+執(zhí)行模塊=基因編輯工具，兩個模塊的重點是定位模塊。設(shè)計靈感源自天然存在的自然遺產(chǎn)、但不止步于天然存在。自然界留給我們很多的提示和啟發(fā)，例如：位點特異重組酶（site specific recombinase）如何？整合酶（integrases）如何？轉(zhuǎn)座酶（transpotase）如何？其它未知的recombinase如何？這個領(lǐng)域的干法和濕法挖掘競賽應(yīng)該一直在進(jìn)行。張鋒曾說到：“通過對多種酶進(jìn)行探索，我們可以得到一個更強(qiáng)的基因組編輯工具箱。我們必須繼續(xù)探索未知。”

最后的花邊：從G0談起，回顧一下“淪落”為小眾的基因編輯工具。

上世紀(jì)七十年代末，利用限制性內(nèi)切酶實現(xiàn)了質(zhì)粒體外重組，標(biāo)志著第一代基因工程的誕生。隨后，基于同源重組的體內(nèi)染色體水平的基因工程成為現(xiàn)實，但是由于重組率極低，必須使用抗生素抗性或營養(yǎng)缺陷等標(biāo)記加以篩選，做不到無痕編輯。之后，盡管發(fā)展了反向篩選標(biāo)記、cre位點預(yù)埋及抗性回收等技術(shù)措施，但是，還是繁瑣和低效。業(yè)界對無標(biāo)記的無痕基因編輯技術(shù)是十分期待的，無標(biāo)記無痕的關(guān)鍵在于編輯效率，只要效率達(dá)到百分之一以上的數(shù)量級別，就有希望。這里讓我們一起回顧一下兩個小眾工具，作為“綠葉”來襯托一下廣為人知的大眾工具。

其一，G0代的重組工程（Recombineering）。上世紀(jì)90年代末，基于λ噬菌體的Red重組酶的重組工程（Recombineering）出現(xiàn)了，這個領(lǐng)域中，中國科學(xué)家于代冠（Daiguan Yu）跟隨NIH的Donald L . Curt，做出了不少貢獻(xiàn)，于代冠博士后來回到了中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院?；赗ed系統(tǒng)，哈佛大學(xué)George Church于2008年在《Nature Biotechnology》上發(fā)表了改進(jìn)版的MAGE，可以自動化地在數(shù)天內(nèi)引發(fā)十億計的突變；至2013年，Church又把基于ss-oligo的的重組工程從大腸桿菌擴(kuò)展到釀酒酵母，這個過程還與rad51/rad54相關(guān)，被Church發(fā)展成YOGE技術(shù)，之所以特別強(qiáng)調(diào)Church，是因為這位偉大的科學(xué)家也是早期CRISPR的推進(jìn)者之一，他采用Cas9編輯高等細(xì)胞基因組的論文，與張鋒“同框”于2013年1月的Science。但是，重組工程最終沒有能夠再擴(kuò)展到其它物種，特別是沒有實現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞的基因編輯。大腸桿菌的Red/ET系統(tǒng)，也是重組工程的重要實現(xiàn)工具，也是目前仍在普遍使用的分子生物學(xué)基本操作工具，這個系統(tǒng)源自中國科學(xué)家張友明在歐洲留學(xué)工作期間做出的開創(chuàng)性工作，張友明博士后來回到山東大學(xué)工作。總體上，基于寡核苷酸入侵的重組工程可擴(kuò)展性不夠好（局限于原核的細(xì)菌、真核最多跨到釀酒酵母），效率相對低下（在千分之一到百分之一之間），難以大幅度優(yōu)化。

其二，G2.5代的Targetron。這個來自原核微生物防御機(jī)制的Targetron技術(shù)，筆者更愿意把它稱之為2.5代技術(shù)，不是因為它的效率，而是因為它的GPS定位模塊的工作方式，其方式是結(jié)合了“個別DNA位點的蛋白質(zhì)識別”和“其它位點的RNA識別”，而且識別序列是可編輯的、可以“reprogrammable”的。這個編輯工具的大本營首推德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校，他們有對外開放的設(shè)計軟件及一些技術(shù)服務(wù)，但是，它編輯復(fù)雜、使用困難、物種可擴(kuò)展性不高，梭狀芽孢桿菌是可以用的，中科院微生物所李寅組和上海的楊晟組都有相關(guān)工作?？傊匀皇且粋€小眾工具。

SGN將會如何？是小眾工具還是能夠發(fā)展成大眾工具呢？pAgo能不能進(jìn)一步W為NgAgo“正名”？能不能正名之后再發(fā)展成大眾工具呢？前提是solid、可重復(fù)，并且用戶友好。讓我們拭目以待吧！

源于天然而超越天然，正道也！再次祝賀南京大學(xué)科學(xué)家在基因編輯領(lǐng)域的這項重大突破！

（原題為《源于天然，超越天然——南京大學(xué)周國華教授DNA編輯論文讀后感》）