據(jù)中科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心微信公眾號(hào)消息，6月15日，《The Journal of Clinical Investigation》期刊在線發(fā)表了題為《人類中腦多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分化標(biāo)志物預(yù)測(cè)帕金森病細(xì)胞治療結(jié)果》的研究論文。

在該研究中，科學(xué)家們解析了中腦多巴胺能神經(jīng)分化的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)了中腦多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞的特異性表面蛋白分子，并且應(yīng)用它們來獲得高純度的目的供體細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定且可預(yù)測(cè)的帕金森病細(xì)胞治療結(jié)果。

該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、靈長(zhǎng)類神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、上海腦科學(xué)與類腦研究中心陳躍軍研究組完成。

全球疾病負(fù)擔(dān)（Global Burden of Disease）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，預(yù)計(jì) 2030 年全球?qū)⒂屑s930萬 帕金森?。≒arkinson’s Disease，PD）患者，其中中國(guó)約有494萬。帕金森病給患者自身帶來極大痛苦，也給家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。帕金森病主要是源于中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變和丟失，造成了紋狀體多巴胺含量顯著性減少，從而引起肌張力增高、運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、和步態(tài)異常等運(yùn)動(dòng)功能障礙。臨床上尚無治愈帕金森病的有效方案，目前的治療方法主要是對(duì)癥治療，包括以左旋多巴為代表的藥物治療和深部腦刺激。然而藥物治療只在早期階段有效，而腦深部刺激只適用于部分病人，隨訪成本高，且會(huì)引起抑郁癥等副作用，因此急需開發(fā)新的治療策略和方法。

細(xì)胞替代療法（細(xì)胞治療）被認(rèn)為是有前景的PD治療策略。細(xì)胞治療通過移植外源神經(jīng)細(xì)胞補(bǔ)充丟失的多巴胺能神經(jīng)元，進(jìn)而恢復(fù)腦內(nèi)多巴胺釋放水平，解救患者運(yùn)動(dòng)功能障礙。人多能干細(xì)胞，包括人胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，可以通過體外分化產(chǎn)生可移植的中腦多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞，為細(xì)胞治療提供了大量的可再生的細(xì)胞資源。目前包括中，美，日，澳在內(nèi)的很多國(guó)家相繼開展了基于人多能干細(xì)胞技術(shù)的PD細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)，然而仍然有很多問題需要解決。（1）體外分化得到的移植用供體細(xì)胞（donor cells）存在高度異質(zhì)性；（2）供體細(xì)胞移植后，腦內(nèi)移植物中的目標(biāo)神經(jīng)元（多巴胺能神經(jīng)元）的比例通常較低（不超過10%）；（3）移植物的細(xì)胞組成未知。因此，如何獲得標(biāo)準(zhǔn)化的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)品，以確保移植后穩(wěn)定且可預(yù)測(cè)的治療效果，仍然是帕金森病細(xì)胞治療在臨床上更廣泛和更安全應(yīng)用面臨的主要挑戰(zhàn)。

為了解決上述問題，研究者們首先繪制了人多能干細(xì)胞向中腦多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分化的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的體外分化過程模擬了多個(gè)但相鄰的人胎腦區(qū)域的發(fā)育過程，包括腹側(cè)中腦、中腦-后腦邊界（MHB，也稱為峽部）和腹側(cè)后腦，其中只有部分腹側(cè)中腦細(xì)胞可以進(jìn)一步分化為中腦多巴胺能神經(jīng)元，而其它腦區(qū)的細(xì)胞則主要分化為GABA能神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和5-羥色胺能神經(jīng)元。這一結(jié)果解釋了人多能干細(xì)胞向中腦多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分化產(chǎn)生異質(zhì)性細(xì)胞類群的原因。

研究者進(jìn)一步重建了人中腦多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的分化軌跡，發(fā)現(xiàn)了代表早期或晚期多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞的特異性表面蛋白分子，CLSTN2和PTPRO，并且這些表面蛋白分子可以用來預(yù)測(cè)體外分化得到的異質(zhì)性神經(jīng)祖細(xì)胞群終末分化為中腦多巴胺能神經(jīng)元的效率（圖1A）。研究者從異質(zhì)性神經(jīng)祖細(xì)胞群中分選富集了分別表達(dá)這些表面分子蛋白的神經(jīng)祖細(xì)胞，并移植到PD模型小鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)分選的神經(jīng)祖細(xì)胞移植后可產(chǎn)生高度富集的中腦多巴胺能神經(jīng)元，比例可高達(dá) 80%，其中大部分（約90%）的多巴能神經(jīng)元為黑質(zhì)中腦多巴胺能神經(jīng)元亞型-PD 患者腦內(nèi)主要缺失的多巴胺能神經(jīng)元亞型。移植物中的多巴胺能神經(jīng)元可以整合到宿主環(huán)路并特異性支配宿主的背側(cè)紋狀體。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，與未分選組相比，分選組的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞具有更高的治療效力，表現(xiàn)為對(duì)宿主紋狀體更強(qiáng)的多巴胺能神經(jīng)支配和只需要移植少量細(xì)胞（常規(guī)治療細(xì)胞劑量的10%）就可以達(dá)到治療效果（圖1B）。

圖1 |（A）通過對(duì)人類中腦多巴胺能體外分化過程進(jìn)行時(shí)程單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，解析了培養(yǎng)物的細(xì)胞類型異質(zhì)性，并找到新型多巴胺能祖細(xì)胞的表面分子標(biāo)記物。（B）將未分選的神經(jīng)祖細(xì)胞與標(biāo)記物分選的神經(jīng)祖細(xì)胞（CLSTN2+ 或 PTPRO+）移植到帕金森病小鼠模型中，通過行為學(xué)、電生理、組織學(xué)染色等手段評(píng)估移植結(jié)果。（C）通過解剖帕金森病小鼠腦中的移植物并進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析，發(fā)現(xiàn)新型標(biāo)記物后的移植物具有穩(wěn)定可預(yù)測(cè)的移植物結(jié)果，目標(biāo)神經(jīng)元（即中腦多巴胺能神經(jīng)元）高度富集，非目標(biāo)神經(jīng)元大部分被剔除。

同時(shí)對(duì)移植物進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，未分選組的移植物中中腦多巴胺能神經(jīng)元比例低，且含有多種類型的非目的神經(jīng)元，其中包括明確能夠造成副作用的五-羥色胺能神經(jīng)元。而分選組中中腦多巴胺能神經(jīng)元被高度富集，非目標(biāo)神經(jīng)元類型大多被剔除（圖2A）。同時(shí)，不同分子標(biāo)記物分選的移植物具有高度一致的神經(jīng)元組成（圖2B），提示移植高度富集的多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞可以獲得穩(wěn)定且可預(yù)測(cè)的移植結(jié)果。

圖2 |（A）未分選的祖細(xì)胞，CLSTN2+ 祖細(xì)胞和 PTPRO+ 祖細(xì)胞衍生的移植物，用人源細(xì)胞核（hN）和多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物 TH 免疫染色的典型圖以及移植物中 TH+ 神經(jīng)元比例的量化。比例尺，100μm。（B）通過解剖帕金森病小鼠腦中的移植物并進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析，發(fā)現(xiàn)新型標(biāo)記物后的移植物具有穩(wěn)定可預(yù)測(cè)的移植物結(jié)果，目標(biāo)神經(jīng)元（即中腦多巴胺能神經(jīng)元）高度富集，非目標(biāo)神經(jīng)元大部分被剔除。

該研究繪制的體外分化和體內(nèi)移植物的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜為中腦多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分化過程中細(xì)胞異質(zhì)性的產(chǎn)生和移植物中非目標(biāo)細(xì)胞的來源提供了更全面的理解。同時(shí)研究者建立了一種獲得高度純化的供體細(xì)胞的方法，這些供體細(xì)胞移植后可以獲得穩(wěn)定且可預(yù)測(cè)的細(xì)胞治療結(jié)果。這一研究為實(shí)現(xiàn)更有效更安全的帕金森病細(xì)胞替代療法邁出了重要的一步。

該研究由腦智卓越中心博士研究生許培博、博士研究生何慧與博士后高琴琴在陳躍軍研究員指導(dǎo)下完成，周盈盈、吳子彥、張曉、孫琳鈺、胡港、管倩、游致文、章馨月、鄭文平和復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院熊曼研究員為本研究提供了重要幫助，斯坦福大學(xué)Aaron Gitler教授和腦智中心梁智鋒研究員對(duì)論文修改給與了寶貴建議。該研究得到科技部、中科院、上海市、基金委的支持。該成果已申請(qǐng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)，并與第三方公司簽署里程碑付款模式的技術(shù)轉(zhuǎn)讓協(xié)議，協(xié)議總金額超過4000萬元人民幣。