撰稿 | 李東宇、朱?（華中科技大學(xué)）

活體腦成像對(duì)于研究大腦生理病理活動(dòng)有著至關(guān)重要的意義?，F(xiàn)代光學(xué)成像技術(shù)因其高分辨率和低侵入性，為活體觀測(cè)大腦皮層結(jié)構(gòu)與功能提供了有效工具。但渾濁的顱骨極大地限制了成像質(zhì)量和成像深度，光學(xué)成像應(yīng)用于皮層觀測(cè)時(shí)往往需要借助各種“顱窗”技術(shù)。

開顱玻璃窗和磨薄顱骨窗是目前最廣為應(yīng)用的顱窗技術(shù)。開顱玻璃窗需要借助外科手術(shù)去除部分顱骨，再在皮層上覆蓋一層玻璃；磨薄顱骨窗需將顱骨磨薄至25 μm以下。近年來，科研人員提出用化學(xué)試劑降低顱骨散射，直接提升顱骨透明度，即“光透明顱窗（Skull optical clearing window）”技術(shù)，這樣可在無需對(duì)顱骨進(jìn)行外科手術(shù)的情況下，實(shí)現(xiàn)皮層成像。

這些顱窗技術(shù)的發(fā)展為實(shí)施皮層神經(jīng)-血管光學(xué)成像提供了重要途徑，而針對(duì)急性腦損傷實(shí)施大視場(chǎng)、高分辨觀測(cè)時(shí)卻顯得無能為力。事實(shí)上，創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是一種臨床常見病，每年約有 6900 萬人遭遇此病，嚴(yán)重的甚至?xí)兴劳鲲L(fēng)險(xiǎn)。因此，發(fā)明一種能滿足急性腦損傷觀測(cè)的無損顱窗技術(shù)，具有重要的科學(xué)意義與臨床價(jià)值。

近日，來自華中科技大學(xué)朱?教授課題組發(fā)展了一種長(zhǎng)效光透明顱窗（Through-Intact-Skull window，簡(jiǎn)稱 TIS 窗），實(shí)現(xiàn)了對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的大視場(chǎng)、高分辨的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)；基于TIS窗，與浙江大學(xué)錢駿教授課題組、奚望副教授課題組合作開展了小鼠皮層深組織成像、并實(shí)現(xiàn)清醒動(dòng)物長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的觀測(cè)。成果以 A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice 為題發(fā)表在eLight期刊。

顱骨的主要成分包括鈣質(zhì)、膠原蛋白、脂類和水，這些組分的折射率各不相同，從而引起了強(qiáng)烈的散射，極大地限制了光學(xué)成像在皮層深組織的成像質(zhì)量。為了減小顱骨的散射，論文作者使用了三種試劑，分別用于膠原解離、去脂和折射率匹配，從而使顱骨變得透明。但純粹的液體試劑根本無法應(yīng)用于清醒或自由活動(dòng)的小鼠皮層的觀察。本文作者在使用光透明試劑之后，進(jìn)一步通過光固化，使顱骨在 2-3 周之內(nèi)一直保持良好的透明狀態(tài)。由于 TIS 窗是在顱骨表面滴加透明試劑，因此可以獲得較大觀測(cè)視場(chǎng)，同時(shí)也能保證較高分辨率（如圖1所示）。

圖1：TIS窗下的雙光子皮層成像。（a）雙側(cè)半腦雙通道成像。（b-d）圖a中對(duì)應(yīng)區(qū)域的放大成像。（e-j）圖b-d中對(duì)應(yīng)區(qū)域的放大成像，可清晰地觀察到神經(jīng)元樹突棘。

利用該技術(shù)，研究人員對(duì)小鼠雙側(cè)皮層視野內(nèi)的長(zhǎng)時(shí)程細(xì)胞追蹤，從而高分辨地觀測(cè)創(chuàng)傷性腦損傷后的全局免疫應(yīng)答（如圖2所示）。

圖2：急性 TBI 后雙側(cè)皮層范圍內(nèi)的細(xì)胞追蹤。（a-r）TBI 后不同區(qū)域內(nèi)的免疫細(xì)胞動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析。該小鼠發(fā)生 TBI 后，在損傷區(qū)域附近、中縫附近和損傷區(qū)域?qū)?cè)均觀察到中性粒細(xì)胞活動(dòng)。經(jīng)量化分析，發(fā)現(xiàn)中縫附近（而非損傷區(qū)域附近）的中性粒細(xì)胞運(yùn)動(dòng)最為劇烈。（s-u）在一只小鼠上觀察到 TBI 2 小時(shí)后發(fā)生腦出血。發(fā)現(xiàn)出血發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度開始加快，出血范圍蔓延至該區(qū)域時(shí)，中性粒細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度到達(dá)頂峰，隨后下降至平穩(wěn)。

此外，研究人員還對(duì) TIS 窗的性能進(jìn)行了全面評(píng)估，透過 TIS 窗實(shí)現(xiàn)小鼠皮層高分辨（神經(jīng)元樹突棘）、大深度（~900 μm）、長(zhǎng)時(shí)程（數(shù)周）成像，并用于清醒動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)的觀測(cè)（如圖3所示）。毫不夸張地說，TIS 窗在具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，擁有了現(xiàn)有顱窗技術(shù)所擁有的全部應(yīng)用場(chǎng)景。

圖3：TIS 窗用于長(zhǎng)期皮層神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)及功能成像（a）皮層血流分布跟蹤。（b）皮層不同深度神經(jīng)元結(jié)構(gòu)長(zhǎng)期成像。（c）清醒小鼠的皮層神經(jīng)活動(dòng)觀測(cè)。

因此，TIS 窗技術(shù)未來在腦科學(xué)的生理病理研究中具有巨大的潛力。

| 論文信息 |

Li, D., Hu, Z., Zhang, H. et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight 2, 15 (2022).

https://doi.org/10.1186/s43593-022-00022-2

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