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13世紀(jì)，馬可波羅將水晶透鏡帶回歐洲，歐洲人因此學(xué)會(huì)了磨制鏡片的方法。當(dāng)時(shí)，發(fā)達(dá)的制造業(yè)令玻璃成為一種廉價(jià)的材料，佛羅倫薩的能工巧匠利用玻璃制作出了第一只眼鏡，從此，眼鏡制造業(yè)橫空出現(xiàn)并且紅紅火火地發(fā)展起來(lái)。然而第一批使用眼鏡的歐洲人，多是年紀(jì)大且老花眼的老年人，他們需要的是可以令他們看清眼前事物的老花鏡，也就是凸透鏡。

早期的眼鏡，來(lái)源：wikipedia

人們很快發(fā)現(xiàn)，凸透鏡可以令物體的影像放大。于是，一些好奇的人們開(kāi)始使用它來(lái)觀(guān)察微小物體。但是這種放大鏡的放大倍數(shù)也就是讓孩子們近距離看看昆蟲(chóng)而已，想要觀(guān)察更加細(xì)微的東西，就只能尋求別的工具。

16世紀(jì)90年代，一位十歲左右的孩子扎卡萊亞斯·詹森（Zacharias Janssen），跟隨父親漢斯·詹森（Hans Janssen）在街頭販賣(mài)自家打磨出來(lái)的鏡片?；蛟S是年幼的他在工作間觀(guān)看父親制作工序時(shí)產(chǎn)生了靈感，他將多塊凸透鏡組合在一起，就是這小小的靈感而引發(fā)的舉動(dòng)，引導(dǎo)了人類(lèi)看向了微觀(guān)世界。

在父親漢斯的幫助下，小詹森制作出了第一臺(tái)顯微鏡，這是一個(gè)構(gòu)造非常簡(jiǎn)單的顯微鏡：它由三個(gè)鏡筒連接而成，中間那個(gè)鏡筒比較粗，適于手握；另外兩個(gè)鏡筒則分別插進(jìn)它的兩端，它們可以伸縮調(diào)整，以達(dá)到聚焦的目的。當(dāng)這個(gè)顯微鏡兩個(gè)活動(dòng)的鏡筒完全收攏時(shí)，它的放大倍數(shù)是3倍；當(dāng)它們完全伸展開(kāi)時(shí)，放大倍數(shù)就有10倍。

詹森復(fù)式顯微鏡，1841年制的復(fù)刻版,來(lái)源：wikipedia

不過(guò)很可惜，詹森父子倆的這個(gè)顯微鏡雖然打開(kāi)了探索微觀(guān)世界的大門(mén)，但卻沒(méi)能讓人們真真正正踏入其中。在那個(gè)認(rèn)知水平有限的年代，人們僅樂(lè)于拿它觀(guān)看跳蚤和其他小昆蟲(chóng)，因此這只顯微鏡又被稱(chēng)作“跳蚤鏡”。

1654年，22歲的列文·虎克（Antonie van Leeuwenhoek）結(jié)束了在阿姆斯特丹布店學(xué)徒的日子，回到家鄉(xiāng)代爾夫，開(kāi)了一家屬于自己的小布店。

早期，他嘗試著用凸透鏡的放大作用來(lái)鑒定布料的質(zhì)量。初始的布料店并不算忙碌，他在閑暇之余，很快就培養(yǎng)起了對(duì)凸透鏡的興趣，并嘗試自己打磨鏡片。列文·虎克這個(gè)沒(méi)上過(guò)幾年學(xué)的年輕人，靠著興趣竟在小店中制造出了世界一流的鏡片。鏡片厚度僅為1毫米，曲率半徑為0.75毫米，有著很高的放大率和分辨率。

在掌握了這項(xiàng)技術(shù)后，列文·虎克將透鏡鑲嵌在兩塊鑿出小孔的黃銅片之間，用螺絲連接在一個(gè)金屬固定器上。螺釘可以用于調(diào)節(jié)標(biāo)本與透鏡之間的距離，以調(diào)整焦距。就此，人類(lèi)歷史上第一臺(tái)真正意義上的顯微鏡誕生了，這臺(tái)顯微鏡放大倍數(shù)可達(dá)720倍，要知道，當(dāng)時(shí)其他可以稱(chēng)得上是顯微鏡的鏡片，放大倍數(shù)最高也只有50倍。

列文虎克在17世紀(jì)設(shè)計(jì)的顯微鏡圖，來(lái)源：wikipedia

列文·虎克對(duì)微觀(guān)世界的興趣日益濃厚，帶著他獨(dú)創(chuàng)的顯微鏡開(kāi)始進(jìn)入科學(xué)領(lǐng)域，看到了他人從未看到的東西。在顯微鏡下，他觀(guān)測(cè)到了池塘水中的原生動(dòng)物，鮭魚(yú)血液中的紅細(xì)胞；他還在牙垢里發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌，并將結(jié)果寫(xiě)成報(bào)告寄給英國(guó)皇家學(xué)會(huì)，獲得了后者的肯定，從而開(kāi)創(chuàng)了微生物學(xué)。

他在微觀(guān)世界里遨游，不斷發(fā)現(xiàn)著各種各樣令人震驚的事實(shí)，從而改變?nèi)藗儗?duì)眼前尋常事物的固有認(rèn)知。

為了提高單鏡片顯微鏡的觀(guān)測(cè)能力，就必須要縮短焦距?？s短焦距必須要縮短鏡片的直徑。變小的鏡片，很容易磨損，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的反復(fù)使用，鏡片變得模糊很難看清。

為解決這個(gè)問(wèn)題，17世紀(jì)左右，英國(guó)皇家學(xué)會(huì)負(fù)責(zé)科學(xué)試驗(yàn)的科學(xué)家羅伯特·虎克（Robert Hooke）制作了一臺(tái)復(fù)式顯微鏡，與列文·虎克使用的單透鏡顯微鏡不同，這種顯微鏡使用了不止一個(gè)鏡片，一個(gè)鏡片下的圖像可以接著被另一個(gè)鏡片放大。復(fù)式顯微鏡里，緊貼物體的鏡片叫“物鏡”，緊貼眼睛的叫“目鏡”。從本質(zhì)來(lái)說(shuō)，其工作原理和外形已經(jīng)很接近現(xiàn)代的光學(xué)顯微鏡了。

羅伯特虎克使用的復(fù)式顯微鏡，來(lái)源：wikipedia

可即便是很接近現(xiàn)代的光學(xué)顯微鏡，卻依然存在著難以突破的問(wèn)題——色差，就是在光線(xiàn)經(jīng)過(guò)透鏡時(shí)，不同顏色的光因折射率不同，會(huì)聚焦于不同的點(diǎn)上，使得觀(guān)察物的成像被一層色彩光斑所包圍，嚴(yán)重影響清晰度。

而且早期玻璃質(zhì)量不高，顯微鏡還存在著球面像差的問(wèn)題，即光線(xiàn)在經(jīng)過(guò)透鏡折射時(shí)，接近中心與靠近邊緣的光線(xiàn)不能將影像聚集在一點(diǎn)上，也會(huì)使得成像模糊不清。

自顯微鏡誕生之日起，色差和球面像差就成為“與生俱來(lái)的頑疾”，一直阻礙著人們向微觀(guān)世界進(jìn)軍的步伐。

直到19世紀(jì)，光學(xué)顯微技術(shù)才在工業(yè)革命的助力下完成了一次實(shí)質(zhì)性蛻變，在根本上解決了這兩個(gè)難題。

1830年，一位英國(guó)業(yè)余顯微鏡學(xué)愛(ài)好者約瑟夫·杰克遜·李斯特（Joseph Jackson Lister)對(duì)顯微鏡的球面像差發(fā)起了挑戰(zhàn)，他創(chuàng)造性地用幾個(gè)特定間距的透鏡組，成功減小了球面像差影響。

1846年，德國(guó)蔡司光學(xué)工廠(chǎng)成立，1857年蔡司工廠(chǎng)研制出第一臺(tái)現(xiàn)代復(fù)式顯微鏡。在研制和生產(chǎn)過(guò)程中，蔡司也難以抗衡色差問(wèn)題。直到1872年，德國(guó)耶拿大學(xué)的恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）教授提出了完善的顯微鏡學(xué)理論，詳細(xì)闡述了光學(xué)顯微鏡的成像原理、數(shù)值孔徑等科學(xué)問(wèn)題。蔡司即刻邀請(qǐng)阿貝教授加盟，他們共同開(kāi)發(fā)出一款劃時(shí)代的光學(xué)部件——復(fù)消色差透鏡，一舉消除了色差的影響。

1862年蔡司生產(chǎn)的現(xiàn)代復(fù)式顯微鏡，來(lái)源：wikipedia

蔡司奠定了現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡的基本形態(tài)，顯微鏡的設(shè)計(jì)已全然建立在健全的物理定律上，而不再是先驅(qū)者的反復(fù)試驗(yàn)。顯微鏡技術(shù)的突飛猛進(jìn)也促使各種現(xiàn)代生物學(xué)理論的不斷提升，透過(guò)高分辨率的透鏡，微觀(guān)世界中各種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)逐步以具象的形式呈現(xiàn)在人類(lèi)眼前。

在這一時(shí)期，微生物學(xué)家通過(guò)給生物樣品染色，來(lái)方便肉眼觀(guān)察。這一方法的局限在于染色劑本身的毒性會(huì)破壞微生物組織結(jié)構(gòu)，直到1930年，荷蘭科學(xué)家澤尼克(Frederik Zernike)提出了相襯法，即通過(guò)空間濾波器將物體的相位信息轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的振幅信息，從而大大提高透明物體的可分辨性。1941年，蔡司將相襯法應(yīng)用于顯微鏡中，由此相差顯微鏡誕生。

二戰(zhàn)結(jié)束后，光學(xué)顯微鏡已得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步，其潛力被挖掘到極致，蔡司工廠(chǎng)以及阿貝教授均認(rèn)為無(wú)法再一次提升微觀(guān)世界的清晰度。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限在0.2微米，能夠看到細(xì)菌和細(xì)胞，再小的物體也就無(wú)能為力了，這一理論被稱(chēng)為“阿貝極限”。

即便是在幾乎觸達(dá)光學(xué)顯微鏡“天花板”的狀態(tài)下，不少科學(xué)家們?nèi)匀幌Ｍ梢越忾_(kāi)“阿貝極限”的枷鎖，而“熒光技術(shù)”就成為了那把鑰匙。

科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，某些物質(zhì)在吸收波長(zhǎng)較短而能量較高的光線(xiàn)，如紫外線(xiàn)時(shí)，能將光源轉(zhuǎn)化為波長(zhǎng)較長(zhǎng)的可見(jiàn)光，這種現(xiàn)象被定義為“熒光現(xiàn)象”。

1911年，德國(guó)科學(xué)家首次研制出熒光顯微鏡裝置，用熒光色素對(duì)被觀(guān)測(cè)樣品進(jìn)行熒光染色處理，并以紫外光激發(fā)樣品的熒光物質(zhì)發(fā)光，但成像效果不佳，而且把熒光物質(zhì)當(dāng)作染色劑，和早期的染色劑一樣，本身的毒性會(huì)傷害活體樣品。

熒光顯微鏡示意圖，來(lái)源：wikipedia

直到1974年，日本科學(xué)家下村修發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白，其毒性遠(yuǎn)弱于以往的熒光物質(zhì)，是對(duì)活體標(biāo)本進(jìn)行熒光標(biāo)記的理想材料。

1989年，科學(xué)家威廉姆·艾斯科·莫爾納爾（William Esco Moerner）提出了一種方法，巧妙繞開(kāi)了大自然對(duì)可見(jiàn)光的限制，通過(guò)提升觀(guān)測(cè)物的可見(jiàn)程度來(lái)實(shí)現(xiàn)突破分辨率0.2微米的極限。

他首次進(jìn)行了單分子熒光檢測(cè)，工作原理類(lèi)似于日光燈中的熒光粉，用特定波長(zhǎng)的光去激發(fā)熒光粉，它們就會(huì)發(fā)射出相應(yīng)的熒光。這一巧妙地發(fā)現(xiàn)，讓光學(xué)顯微鏡的檢測(cè)尺度精確到納米量級(jí)成為可能。隨后在此基礎(chǔ)上，美國(guó)科學(xué)家羅伯特·埃里克·貝齊格（Robert Eric Betzig）開(kāi)發(fā)出一套新的顯微成像方法：控制觀(guān)測(cè)物的熒光分子，讓少量分子發(fā)光，只要每?jī)蓚€(gè)分子之間的距離大于0.2微米，光學(xué)顯微鏡就可以清晰地觀(guān)測(cè)到。通過(guò)對(duì)同一區(qū)域反復(fù)成像，最后用軟件重現(xiàn)所有的閃光點(diǎn)，科學(xué)家就得到了納米尺度的稠密、精確圖像。通過(guò)這種方法，貝齊格輕而易舉地突破了光學(xué)顯微鏡的“阿貝極限”。

熒光顯微鏡下的細(xì)胞，來(lái)源：wikipedia

可見(jiàn)光存在著“阿貝極限”，那么如果利用波長(zhǎng)較短的光束是否也能突破分辨率的桎梏呢？

1931年，德國(guó)科學(xué)家諾爾（Max Knoll）和他的學(xué)生魯斯卡（Ernst Ruska）在一臺(tái)高壓示波器上加入了一個(gè)放電電子源和三個(gè)電子透鏡，制成了世界上首臺(tái)電子顯微鏡。

首臺(tái)電子顯微鏡，來(lái)源：wikipedia

電子顯微鏡，是利用電子束轟擊固體樣品，在其表面或內(nèi)部發(fā)生散射時(shí)，各種散射信號(hào)被相應(yīng)探測(cè)器采集后，可直接或間接體現(xiàn)固體樣品在微觀(guān)區(qū)域獨(dú)特的物理化學(xué)信息。電子顯微鏡完全不受“阿貝極限”的約束，在分辨率上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了光學(xué)顯微鏡，達(dá)到納米級(jí)別（1微米=1000納米），在這個(gè)觀(guān)測(cè)尺度下，人類(lèi)看到了比細(xì)菌更小的微生物——病毒。

電子顯微鏡是人類(lèi)認(rèn)識(shí)超微觀(guān)世界的途徑，從肉眼可見(jiàn)的毫米尺度，到光學(xué)顯微鏡可達(dá)的微米尺度，再到電子顯微鏡下的納米尺度，顯微成像技術(shù)正在迅速突破人類(lèi)對(duì)微觀(guān)世界的認(rèn)知極限。

電子顯微鏡所具備的超高分辨率是光學(xué)顯微鏡無(wú)法企及的高度，但是電子顯微鏡的缺憾也漸漸顯露出來(lái)。電子加速只可以在真空條件下實(shí)現(xiàn)，然而，處于真空環(huán)境下的生物，往往要經(jīng)過(guò)脫水和干燥，這意味著電子顯微鏡下沒(méi)有活體狀態(tài)的生物樣本，并且電子束本身也容易破壞樣品表面的生物分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致一些關(guān)鍵信息無(wú)法被生物學(xué)家們順利捕捉到。

橫跨五十年，直到1981年，在蘇黎世的IBM實(shí)驗(yàn)室中，科學(xué)家蓋爾德·賓尼（Gerd Bining）和海因里?！ち_雷爾（Heinrich Rohrer）采用了一些看似離經(jīng)叛道的方法，改變了電子顯微鏡損傷樣品結(jié)構(gòu)的問(wèn)題。他們利用量子物理學(xué)中的“隧道效應(yīng)”，制作了一臺(tái)掃描隧道顯微鏡。

掃描隧道顯微鏡，來(lái)源：wikipedia

與傳統(tǒng)的光學(xué)和電子顯微鏡不同，這種顯微鏡連鏡頭都沒(méi)有。在工作時(shí)，用一根探針接近觀(guān)測(cè)物，并在兩者之間施加電壓，當(dāng)探針距離樣品只有納米級(jí)時(shí)就會(huì)產(chǎn)生隧道效應(yīng)——電子從這細(xì)微的縫隙中穿過(guò)，形成微弱的電流，這股電流會(huì)隨著探針與樣品距離的變化而變化，通過(guò)測(cè)量電流的變化人們就能間接得到觀(guān)測(cè)物的大致形狀。由于全程沒(méi)有電子束參與，掃描隧道顯微鏡從根本上避免了加速電子對(duì)生物樣品表面的破壞。

隨后幾年，蓋爾德·賓尼（Gerd Bining）又與C.FQuate和C.Gerber等人，研制成功了原子力顯微鏡，原子力顯微鏡利用微懸臂感受和放大懸臂上尖細(xì)探針與受測(cè)樣品原子之間的作用力，從而達(dá)到檢測(cè)的目的，具有原子級(jí)的分辨率。由于原子力顯微鏡既可以觀(guān)察導(dǎo)體，也可以觀(guān)察非導(dǎo)體，從而彌補(bǔ)了掃描隧道顯微鏡的不足，極大拓寬了人類(lèi)對(duì)于生物、化學(xué)、材料、物理等領(lǐng)域的認(rèn)知疆界。目前，電子顯微鏡已經(jīng)成為金屬、半導(dǎo)體和超導(dǎo)體領(lǐng)域的主力軍。

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，科學(xué)家們?nèi)匀辉趯ふ夷軌驑O大程度避免電子束損害生物樣品的辦法，他們從另一個(gè)角度出發(fā)，在不改變電子顯微鏡整體工作模式的情況下，去改變觀(guān)測(cè)物本身，對(duì)其進(jìn)行超低溫冷凍處理，研發(fā)冷凍電鏡技術(shù)。由于觀(guān)測(cè)溫度低，生物樣品也處于含水狀態(tài)，分子也處于天然狀態(tài)，樣品對(duì)輻射的耐受能力得以提高。

利用這項(xiàng)技術(shù)，科學(xué)家們可以將樣品凍結(jié)在不同的狀態(tài)，觀(guān)測(cè)分子結(jié)構(gòu)的變化。在新冠疫情爆發(fā)后，冷凍電鏡技術(shù)為人類(lèi)研究和抗擊疫情做出了突出貢獻(xiàn)。

2020年，我國(guó)的科學(xué)團(tuán)隊(duì)周強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室就在BioRxiv上發(fā)表了新冠病毒的受體—ACE2的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，利用的就是冷凍電鏡技術(shù)來(lái)成像，這讓人類(lèi)對(duì)新冠病毒的認(rèn)識(shí)又向前邁進(jìn)了一步。

冷凍電鏡技術(shù)成像，來(lái)源：百度

冷凍電鏡技術(shù)成像動(dòng)態(tài)圖，來(lái)源：百度

時(shí)至今日，人類(lèi)對(duì)微觀(guān)世界的探究從未停止，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡互補(bǔ)互足、相得益彰。未來(lái)，更加廣闊的和更加多元化的顯微成像技術(shù)，將會(huì)進(jìn)一步完善我們生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、物理等各個(gè)領(lǐng)域的知識(shí)結(jié)構(gòu)，將包羅萬(wàn)象的世界展現(xiàn)在我們的眼前。

這復(fù)雜而長(zhǎng)久的探索旅程，使我們明白：看見(jiàn)不可見(jiàn)，不只是一種想象。

Reference:

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http://zhishifenzi.com/depth/newsview/1891

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https://chanzuckerberg.com/blog/the-past-present-and-future-of-medical-imaging/

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https://zj.zjol.com.cn/news.html?id=594912

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