【編者按】2022年10月，全球唯一一名參與CRISPR基因編輯療法的杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）志愿者，在治療過程中死亡。復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞與遺傳醫(yī)學系研究員楊云龍表示：CRISPR相關(guān)技術(shù)作為一種高效且廣泛應用的基因編輯方法，是當前研究的熱點。將其應用于臨床，由于涉及到倫理和監(jiān)管問題，也常常成為爭議的焦點。他希望更關(guān)注DMD這一遺傳性罕見病本身，DMD目前還沒有治愈方法?！白R病尋源”是楊云龍在澎湃科技開設(shè)的獨家專欄。

2022年11月10日，《科學》雜志（Science）的新聞欄刊登了一條信息[1]：一名27歲杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者在一項新型基因編輯試驗中死亡。雖然信息披露尚不充分，但許多科學家認為，這名患者確實通過病毒輸注，接受了基于CRISPR的治療。

根據(jù)ClinicalTrials.gov上的注冊信息(NCT05514249)，該臨床試驗僅有一名參與者。受試者2022年8月底在美國馬薩諸塞大學醫(yī)學院接受了靜脈輸注，約6周后去世。CRISPR相關(guān)技術(shù)作為一種高效且廣泛應用的基因編輯方法，是當前研究的熱點。將其應用于臨床，由于涉及到倫理和監(jiān)管問題，也常常成為爭議的焦點。由于基因編輯的話題性，大量的新聞網(wǎng)站報道了該事件。但新聞報道中并未對受試者患有的杜氏肌營養(yǎng)不良癥作詳盡解釋。例如，在美國廣播公司（American Broadcasting Company, ABC）的報道中，僅有一句話描述該?。骸斑@種罕見的遺傳性肌肉萎縮疾病是由產(chǎn)生一種叫做肌營養(yǎng)不良蛋白的基因突變引起”。

杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD）得名于紀堯姆·本杰明·阿曼德·杜興（Guillaume Benjamin Amand Duchenne, 1806-1875）。他是200年前的法國神經(jīng)生物學家，進行了肌肉電刺激的開創(chuàng)性研究。杜興不僅嘗試用電治療肌肉問題，還將電作為研究解剖結(jié)構(gòu)和生理學的研究手段。他發(fā)明了“杜興機”—一種用電刺激肌肉的便攜裝置，極大地豐富了電生理學研究。使用該裝置，他發(fā)現(xiàn)假笑不涉及眼睛周圍的肌肉，而發(fā)自內(nèi)心的微笑涉及眼周和嘴部肌肉。如今，這種需要調(diào)動眼輪匝肌的真誠笑容被稱為“杜興笑”。實驗過程中拍攝的電刺激面部肌肉的照片令人印象深刻，廣為傳播。部分原始照片現(xiàn)已被收入美國紐約的現(xiàn)代藝術(shù)博物館（Museum of Modern Art, MoMA）

杜興用電刺激受試者面部肌肉的照片，1856。來源：MoMA館藏。

1842年起，杜興在巴黎開展肌營養(yǎng)不良和其他神經(jīng)肌肉疾病的研究，嘗試用電刺激觸發(fā)特定肌肉運動，并詳細描述了幾類神經(jīng)肌肉疾病。在杜興之前，DMD的病例已經(jīng)被零星地描述過，如1830年，英國著名醫(yī)生查爾斯·貝爾（Charles Bell, 1774-1842）描述了一名肌肉進行性麻痹導致下肢癱瘓的18歲男子，從10歲起大腿無力，不能站立[2]。1847年理查德·帕特里奇（Richard Partridge，1805–1873）第一次對DMD患者進行病理尸檢，發(fā)現(xiàn)“肌肉出現(xiàn)脂肪變性，小腿變性程度高于上肢，神經(jīng)和肌腱都沒有發(fā)生變化”[3]。1851年，愛德華·梅里恩（Edward Meryon，1807–1880）首次對DMD進行了明確的臨床和病理描述，他向倫敦皇家醫(yī)學和外科學會提交了論文，描述患者尸檢結(jié)果：“在顯微鏡下檢查肌肉組織時，發(fā)現(xiàn)條紋狀纖維被完全破壞，肌節(jié)成分彌散，在許多地方轉(zhuǎn)化為脂滴和顆粒物，肌纖維膜被破壞”[4]。梅里恩最初認為DMD患者是由于脊髓問題導致，但經(jīng)過仔細檢查，他發(fā)現(xiàn)患者神經(jīng)組織是完整的，觀察到的唯一結(jié)構(gòu)變化是肌纖維改變，脂肪填充了肌肉纖維鞘。從1851年到1870年，梅里恩一直對這一疾病開展研究，可能是全面總結(jié)DMD的第一人。杜興則首次拍攝了DMD患者的照片，1862年發(fā)表在照片集《病理攝影集》（Album de photographes pathologiques）中[5]，這也是首次出版的臨床影像資料的書籍。更進一步，杜興發(fā)明了一種肌肉活檢針，于1864年應用，對一名DMD患者肌肉進行了活檢觀察。杜興高質(zhì)量地確定了DMD的關(guān)鍵病理結(jié)果，并在1868年總結(jié)了該病的特征。隨后，神經(jīng)科學家威廉·理查德·高爾斯爵士（Sir William Richard Gowers，1845–1915）在觀察了多個家系后得出結(jié)論，DMD是一種具有明顯男性偏好的早發(fā)性遺傳疾病，其病因來自卵子。大多數(shù)病例6歲前發(fā)病，由于腿部肌肉乏力，具有特征性的站起姿勢。高爾斯嘗試過多種療法，包括杜興的電刺激療法，未觀察到療效[6]。在確定DMD的疾病特征、病理改變的過程中，杜興、高爾斯等人做出了大量的貢獻。2003年，《神經(jīng)病學年鑒》（Annals of Neurology）期刊主編Kenneth Tyler教授對DMD的早期探索歷史進行了總結(jié)，并在美國神經(jīng)病學年會上報告[7]。

杜興為他第一位DMD患者拍攝的影像資料。來源：[4]

進入20世紀，DMD研究一度陷入沉寂。直到進入分子時代，大量的遺傳學研究和分子生物學研究聚焦于該疾病，極大地豐富了我們對DMD的認知。通過流行病學調(diào)查，我們知道杜氏肌營養(yǎng)不良（DMD）是一種X連鎖隱性遺傳病，發(fā)病率在男性嬰兒中約十萬分之10，屬于發(fā)病率較高的遺傳病。另一類稱為貝氏肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy, BMD）與其發(fā)病機理類似，發(fā)病率為約十萬分之8。它們在女性中極為罕見。

究其病因，DMD和BMD是由肌細胞中一個重要蛋白Dystrophin遺傳改變，導致結(jié)構(gòu)及功能缺失所致。編碼蛋白的基因體量巨大，是人類基因組中最大的基因之一。具有79個外顯子，翻譯出的蛋白質(zhì)量有427kDa。Dystrophin通過兩端的結(jié)構(gòu)域?qū)⒓毎羌艿鞍譌-actin與細胞外基質(zhì)連接起來。此外，Dystrophin還結(jié)合肌膜、細胞骨架、通道蛋白以及信號蛋白，形成復雜的復合物，并介導一系列功能。目前對這些功能的理解還不充分。在DMD患者中，Dystrophin被截斷，導致細胞骨架無法連接到細胞外基質(zhì)。在BMD中，Dystrophin的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域尚存，但結(jié)構(gòu)不完整，所以病情較輕。遺傳突變是導致Dystrophin丟失或損傷的直接原因。迄今，已在DMD和BMD患者中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種不同類型的突變。大多數(shù)的突變發(fā)生在熱點區(qū)域，即3號-9號外顯子以及45號-55號外顯子區(qū)域。

Dystrophin可以和多種蛋白結(jié)合，其缺失廣泛影響肌細胞功能。來源：[8]

Dystrophin發(fā)生問題后，以其為中心的復合物會解體，肌細胞結(jié)構(gòu)完整性、肌肉收縮能力、肌細胞的信號傳導都會受到影響。體現(xiàn)在肌細胞上，就是肌膜易受收縮損傷、細胞被自由基損傷、鈣離子超載、再生受阻等。這些受損的肌細胞會被炎癥細胞識別并清除。在疾病早期，受損肌肉尚可通過再生修復。但在晚期，由于再生能力降低和纖維化信號上調(diào)，肌細胞被脂肪組織和纖維化組織取代，進而影響患者運動能力。

DMD目前沒有治愈方法，但合理治療可緩解疾病進展，減輕患者負擔。在疾病診斷方面，若發(fā)現(xiàn)男孩有癥狀，要對患者家庭開展基因咨詢，協(xié)助診斷。這有助于分型并指導未來治療。在治療方面，目前的標準方案是：DMD患兒在其運動發(fā)育停止時（一般在4-5歲）使用糖皮質(zhì)激素，并在整個生命周期內(nèi)持續(xù)治療，這主要是由于糖皮質(zhì)激素可促進肌細胞增殖同時抑制炎癥。該療法可延緩病情，增進患者生存。同時，對癥的多學科治療和高質(zhì)量的護理也可改善生活質(zhì)量和壽命。這包括醫(yī)師、護士、康復師、營養(yǎng)師、心理醫(yī)生等的共同合作。對于DMD的診療方案，2018年發(fā)表于Lancet Neurology的指南做了最為完善的總結(jié) [9-11]。

由于DMD的不可治愈，在科研領(lǐng)域，科學家仍在不斷尋找肌營養(yǎng)不良的療法，確認Dystrophin缺失是病因后，一個樸素的“治本”的想法就是能否令肌細胞重新表達這一蛋白。由于編碼蛋白的基因體量過大，直接導入全長基因并不現(xiàn)實。于是科學家們開發(fā)了一系列新療法，主要包括基因療法和細胞療法。具體可分為以下幾類：

終止密碼子通讀：有5%-7%的DMD病例，是由于基因突變形成了終止密碼子，也就是無義突變。該突變導致Dystrophin合成提前終止。若能強制要求蛋白繼續(xù)合成，就可能得到一個全長的蛋白，從而治療疾病。一種小分子藥物Ataluren可以誘導核糖體在遇到無義突變時繼續(xù)向下翻譯。在臨床試驗中，該藥物未能達到主要終點，但顯示了一定的治療趨勢，且安全性良好。因此得到了歐洲藥監(jiān)局的條件性使用批準。

外顯子跳躍：蛋白表達需要先轉(zhuǎn)錄為mRNA，通過剪接將多個外顯子拼在一起。某些特定的突變可導致蛋白合成提前終止。若能跳過該突變所在的外顯子區(qū)域，產(chǎn)生一個不是全長的蛋白。雖然仍不及健康蛋白，但可顯著減輕病情。這一方法利用寡核苷酸片段改變剪接過程，體積小，易于遞送，安全性好。該方法針對不同突變要設(shè)計不同的寡核苷酸藥物，目前的藥物針對突變最多的群體，如外顯子44、45、51、53等，需要重復治療。其中部分藥物已獲美國藥監(jiān)局的條件性使用批準。

表達微型蛋白：使用腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus, AAV）可遞送cDNA，令感染的組織表達特定蛋白。該方法也是其他基因療法中常見方案。但在DMD中，由于AAV容量有限，無法運載編碼Dystrophin的載體。于是科學家提出了僅將最關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域重組為微型蛋白，再用AAV導入的方法。臨床試驗結(jié)果證實，微型蛋白在受試者肌細胞中成功表達，但目前還不知道對疾病的改善情況。需要注意的是，AAV可能導致患者出現(xiàn)嚴重的免疫反應。即使對患者進行了預篩選和免疫抑制，仍有患者出現(xiàn)了嚴重不良事件。 2021年12月，輝瑞公司在一例受試者報告死亡后，暫停臨床試驗，目前正在恢復中。

基因組編輯技術(shù)：如果能夠?qū)蚪M直接進行靶向修飾，糾正突變，或者將導致蛋白丟失的突變刪除或替換，是非常有吸引力的方法。通過設(shè)計引導RNA，引入CRISPR系統(tǒng)，可以做到在基因組特定位點刪除外顯子、取消剪接位點等。該方法在動物實驗中已獲成功。但由于基因編輯的脫靶風險和對其中的蛋白或病毒載體產(chǎn)生免疫反應的風險，基因組編輯尚未進入臨床。開篇提及的新聞報道中，死亡的患者可能參加了這一療法的臨床研究。

干細胞移植：將帶有正?；虻母杉毎浦玻迯图∪?。雖然該方法有吸引力，但肌肉組織的體量對該方法提出了挑戰(zhàn)。臨床試驗也發(fā)現(xiàn)，僅在局部注射的位置旁有一些恢復。該方法目前未獲批準。

類似蛋白替代：Dystrophin有一種類似蛋白稱為Utrophin，若上調(diào)其表達可產(chǎn)生一定的代償效應。有臨床試驗研究了能夠上調(diào)Utrophin的藥物，但未觀察到治療效果。

除了這些“治本”的療法，還有許多藥理學藥物在臨床試驗中，或可通過減少纖維化、減輕炎癥，擴張血管、保護線粒體功能、靶向肌肉調(diào)節(jié)蛋白等不同機制，可能緩解病情[12]。

從患者的角度看來，多種療法帶來了治愈疾病的希望，但治療方案與患者的適配性仍有待考量，且方法之間可能互斥。綜合比較，表達微型蛋白是一種普適的方法，但其仍存在安全隱患。其不良反應可能主要由AAV介導，涉及制造過程中的諸多因素，如劑量、AAV類型、轉(zhuǎn)入的載體、患者是否已有抗體等。開篇提到的新聞報道中，患者應該是選擇了基于CRISPR的基因組編輯技術(shù)。報道體現(xiàn)了公眾對以CRISPR為代表的基因療法的擔憂。在該試驗更多信息披露之前，更重要的可能是提高公眾對疾病和各類療法的深入理解。更進一步，患者和患者家屬通過理解相關(guān)研究，決定治療方案，決定是否參與前沿療法的臨床研究，需要勇氣、知識、智慧和積極的人生觀。而對于患有DMD這樣的罕見病患者，在某種程度上，積極的人生觀要比新穎的療法更為重要。

（作者楊云龍，系復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞與遺傳醫(yī)學系研究員、副主任。疾病不斷地改變著每個人的人生軌跡。但除了醫(yī)生與醫(yī)學研究者，人們很少有機會了解各式各樣的疾病?！白R病尋源”專欄將以一文一病的形式，介紹對疾病的認識進程，疾病的病因及其治療。跟隨醫(yī)學科學的進步，理解現(xiàn)代醫(yī)學。）

參考文獻

1.      https://www.science.org/content/article/news-glance-new-antibiotic-covid-19-antarctica-and-venus-mission-deferred. doi: 10.1126/science.adf7363

2.      Bell, C., The nervous system of the human body : embracing the papers delivered to the Royal Society on the subject of the nerves. 1830, London: Longman, Rees, Orme, Brown, and Green. xxiii, 238, clxxvi p., 9 leaves of plates.

3.      Patridge R. Fatty degeneration of muscle. Med Times Gaz 1847; 5: 944.）

4.      Meryon, E., On Granular and Fatty Degeneration of the Voluntary Muscles. Med Chir Trans, 1852. 35: p. 73-84 1.

5.      Duchenne GBA. Album de photographes pathologiques. Paris: Bailliere; 1862.

6.      Gowers WR. Clinical lecture on pseudo-hypertrophic muscular paralysis. Lancet 1879; 2: 1–2, 37–39, 73–75, 113–116.

7.      Tyler, K.L., Origins and early descriptions of "Duchenne muscular dystrophy". Muscle Nerve, 2003. 28(4): p. 402-22.

8.      Duan, D., et al., Duchenne muscular dystrophy. Nat Rev Dis Primers, 2021. 7(1): p. 13.

9.      Birnkrant, D.J., et al., Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and neuromuscular, rehabilitation, endocrine, and gastrointestinal and nutritional management. Lancet Neurol, 2018. 17(3): p. 251-267.

10.   Birnkrant, D.J., et al., Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: respiratory, cardiac, bone health, and orthopaedic management. Lancet Neurol, 2018. 17(4): p. 347-361.

11.   Birnkrant, D.J., et al., Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 3: primary care, emergency management, psychosocial care, and transitions of care across the lifespan. Lancet Neurol, 2018. 17(5): p. 445-455.

12.   Markati, T., et al., Emerging therapies for Duchenne muscular dystrophy. Lancet Neurol, 2022. 21(9): p. 814-829.