人類基因組序列20多年前已經(jīng)基本測畢，但其功能至今仍然鮮為人知，基因組大體上仍然是一部天書，這已經(jīng)成為疾病診療的一個(gè)巨大障礙。因此，在后基因組時(shí)代，生物醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)主要目標(biāo)便是破譯基因組（尤其是2萬個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因）的功能。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的有效策略是對這些基因在每種細(xì)胞類型中的表達(dá)進(jìn)行干擾，并描述這種擾動(dòng)對細(xì)胞的直接、內(nèi)在的影響，即繪制"擾動(dòng)圖譜"（Perturb Atlas）。但不幸的是，現(xiàn)有的基因靶向方法很難適用于擾動(dòng)圖譜的繪制。為了突破這個(gè)困境，作者開發(fā)了新一代小鼠基因打靶技術(shù)iMAP（inducible Mosaic Animal for Perturbation）。iMAP融合了2大底層技術(shù)：基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)和基于Cre-loxP的基因重組技術(shù)。 

該技術(shù)的核心是一個(gè)由多達(dá)100個(gè)sgRNA編碼基因串聯(lián)而成的轉(zhuǎn)基因。這是一個(gè)新型的sgRNA文庫，其sgRNA平時(shí)不表達(dá)，但在藥物（他莫昔芬）的誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)基因發(fā)生重組，使100個(gè)sgRNA都得以在小鼠表達(dá)， 但每個(gè)細(xì)胞只隨機(jī)表達(dá)一個(gè)其中一個(gè)，后者募集Cas9敲除相應(yīng)的靶基因，從而將小鼠轉(zhuǎn)化為嵌合體。嵌合鼠可用于普查100個(gè)基因在小鼠各種組織細(xì)胞的功能，從而繪制擾動(dòng)圖譜，也可以通過簡單的配繁，衍生出上百個(gè)單基因敲除品系，從而大大降低其制備成本。

iMAP 的原理

該工作首先利用6個(gè)功能已知的基因，做了概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示了iMAP的穩(wěn)健性，而且顯示，軟件設(shè)計(jì)的sgRNA大多具有足夠的活性和高度特異性，提示可以只用一個(gè)sgRNA靶向每個(gè)基因。接下來作者構(gòu)建了一個(gè)新品系，靶向90個(gè)功能大多未知的基因，并鑒定了這些基因?qū)?9種成年鼠組織細(xì)胞豐度（反映存活、增殖、分化）的影響，繪制了首張擾動(dòng)圖譜。該圖譜提供了關(guān)于這些基因的豐富信息， 導(dǎo)致了一系列新發(fā)現(xiàn) （例如發(fā)現(xiàn)Hdac7是腫瘤免疫療法高效靶點(diǎn)）。 這張擾動(dòng)圖譜必將催生覆蓋全部基因和組織的“全景圖”，后者將有助破譯生命天書，并將成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要分水嶺，因?yàn)樗沟锰剿骰蚧竟δ茏兊孟癫樽值湟粯雍唵巍?nbsp;

iMAP有多個(gè)未來發(fā)展方向。首先，iMAP需要優(yōu)化，因?yàn)槊總€(gè)品系只靶向100個(gè)目標(biāo)基因， 而且在靜息細(xì)胞中，基因敲除效率較低 （這可能是Cas9本身的局限性）。其次，該研究使用sgRNA豐度作為iMAP擾動(dòng)的readout。然而，單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀組學(xué)理論上都可作為readout，以更全面地揭示基因功能。此外，iMAP還可與基因敲除之外的其他CRISPR擾動(dòng)形式相結(jié)合，包括基因沉默、激活和RNA降解，后者是探索非編碼RNA功能的理想技術(shù)。除了在健康小鼠中系統(tǒng)地繪制擾動(dòng)圖譜，在疾病模型中進(jìn)行的iMAP篩選可助力新藥靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和老藥新用。最后，iMAP可能適用于小鼠以外的其他多細(xì)胞生物（包括植物）。

英文全文鏈接：

https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnac057

引用本文：

Yiwen Sun, Wenyanag Lin, Ravinder Kaundal, Tian Chi, iMAPping the Perturb-Atlas, Life Medicine, 2022;, lnac057, https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnac057