為了在瘙癢-抓撓過程中，使用化學(xué)遺傳學(xué)抑制雙側(cè)PrL腦區(qū)，向大鼠的雙側(cè)PrL腦區(qū)各注射病毒載體rAAV2/9-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry或rAAV2/9-hSyn-mCherry，PrL腦區(qū)的注射坐標(biāo)為：（AP+3.10mm，ML±0.70mm，DV-4.30mm）。術(shù)后回動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)，至少給予3周的恢復(fù)和病毒表達(dá)時(shí)間再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

為了在瘙癢-抓撓過程中，使用光遺傳學(xué)抑制雙側(cè)PrL腦區(qū)，向大鼠的雙側(cè)PrL腦區(qū)各注射病毒載體rAAV2/9-hSyn-eNpHR3.0-EYFP（AAV-hSyneNpHR3.0-EYFP或rAAV2/9-hSyn-EYFP，PrL腦區(qū)的注射坐標(biāo)為：（AP+3.10mm，ML±0.70mm，DV-4.30mm）。病毒注射至少3周后，使用腦立體定位儀將2根光纖插芯以15度斜角植入到PrL腦區(qū)的病毒注射位置上方（AP+3.10mm，ML±0.70mm，DV-4.00mm），并用牙科水泥固定光纖插芯和螺絲釘。術(shù)后回動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)，至少再給予動(dòng)物1周的術(shù)后恢復(fù)時(shí)間再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

有線智能光遺傳系統(tǒng)--單光源，XR-P01型

動(dòng)物急性瘙癢模型的建立

根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，急性瘙癢行為學(xué)測(cè)試2天前，使用動(dòng)物剃毛器剃除動(dòng)物頸背部、臉頰一小塊被毛。為了使用磁感應(yīng)法自動(dòng)記錄和分析動(dòng)物的抓撓行為，在每天的適應(yīng)和后續(xù)的行為學(xué)測(cè)試前，將一個(gè)小稀土磁環(huán)（外徑：11–12mm，內(nèi)徑：7.8–8.8mm，高：2mm）套在每只動(dòng)物的后肢上，每天的適應(yīng)和后續(xù)的行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，取下每只動(dòng)物后肢上的小磁環(huán)。行為學(xué)測(cè)試前將動(dòng)物放置在行為記錄箱（30×33×35cm）中適應(yīng)2天，30min/天。行為記錄箱放置在一個(gè)隔音、隔光的屏蔽柜內(nèi)。行為記錄箱的外側(cè)纏繞有多圈磁感應(yīng)線圈，磁感應(yīng)線圈依次連接到16通道差分放大器和16通道生理信號(hào)記錄儀，用于記錄動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的感應(yīng)電信號(hào)。此外，為了采用視頻法同步記錄動(dòng)物的行為，并對(duì)比采用2種方法記錄動(dòng)物抓撓行為的一致性，在行為記錄箱正上方的攝像頭通過記錄動(dòng)物的行為視頻。

瘙癢行為測(cè)試

在行為學(xué)測(cè)試階段，先將動(dòng)物放置在行為記錄箱內(nèi)記錄15min的基線數(shù)據(jù)。然后將動(dòng)物拿出行為記錄箱，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將不同的致癢劑皮內(nèi)注射到動(dòng)物剃毛區(qū)域（頸背部或臉頰）。對(duì)于臉頰瘙癢模型，向大鼠臉頰皮內(nèi)注射5-HT或氯喹。對(duì)于頸部瘙癢模型，向大鼠頸部皮內(nèi)注射50μL的5-HT或氯喹。注射完畢后立即將動(dòng)物放回行為記錄箱內(nèi)，記錄30min內(nèi)的動(dòng)物抓撓行為。

為了分析動(dòng)物的抓撓行為，主要通過磁感應(yīng)法記錄注射了致癢劑的同側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)情況。附著在后肢上的磁環(huán)運(yùn)動(dòng)能使行為記錄箱外的磁感應(yīng)線圈產(chǎn)生感應(yīng)電。感應(yīng)電信號(hào)經(jīng)16通道差分放大器濾波(3-100Hz)、放大后，通過生理信號(hào)記錄儀記錄，采樣率為1kHz。通過對(duì)比分析視頻法和磁感應(yīng)法記錄的大鼠抓撓行為，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物后肢的抓撓行為與其它后肢運(yùn)動(dòng)不同時(shí)發(fā)生，動(dòng)物的抓撓和后肢運(yùn)動(dòng)（如行走）均能產(chǎn)生感應(yīng)電，然而抓撓行為能引起一組電壓波動(dòng)，并具有周期性特征。

分析視頻法記錄動(dòng)物的抓撓行為時(shí)，采用雙盲原則統(tǒng)計(jì)動(dòng)物抓撓次數(shù)，動(dòng)物抬起后肢抓撓注射部位而后放入口中或地上統(tǒng)計(jì)為1次抓撓行為。

在體光遺傳學(xué)

對(duì)于在體光遺傳學(xué)抑制實(shí)驗(yàn)，在行為學(xué)測(cè)試過程中，通過連接在593-nm黃光激光器上的光纖給予表達(dá)了eNpHR3.0-EYFP或EYFP的PrL黃光照射。在30min內(nèi)的行為測(cè)試過程中，黃光激光器按照5min關(guān)閉-5min打開周期（重復(fù)3次）模式給予光照，刺激參數(shù)為593nm，~5mW，持續(xù)光照。

將植入動(dòng)物后爪的小磁柱更換成可以套在后肢上的小磁環(huán)，以提高動(dòng)物的適應(yīng)性。接下來，通過對(duì)比分析視頻法和磁感應(yīng)法記錄動(dòng)物的抓撓行為，以確定改良的磁感應(yīng)法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。改良的磁感應(yīng)法能穩(wěn)定地記錄到動(dòng)物的后肢運(yùn)動(dòng)，包括抓撓行為及其他運(yùn)動(dòng)（如行走）。通過對(duì)比分析24只動(dòng)物在注射致癢劑前15min內(nèi)的自發(fā)抓撓次數(shù)，發(fā)現(xiàn)磁感應(yīng)法記錄的自發(fā)抓撓次數(shù)與視頻法記錄的自發(fā)抓撓次數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣，采用磁感應(yīng)法和視頻法同步記錄左頸部注射5-HT后，30min內(nèi)的24只動(dòng)物抓撓次數(shù)。

磁感應(yīng)法記錄瘙癢-抓撓行為具有良好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性

參考文獻(xiàn)

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3、Ethanol blocks a novel form of iLTD, but not iLTP of inhibitory inputs to VTA GABA neurons.[J]. Nufer Teresa M;Wu Bridget J;Boyce Zachary;Steffensen Scott C;Edwards Jeffrey G.Neuropsychopharmacology : official publication of the American College of Neuropsychopharmacology,2023

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