下肢缺血性疾病是由下肢動(dòng)脈狹窄或閉塞所致的嚴(yán)重的肢體血液循環(huán)障礙，可引起潰瘍、壞疽、跛行等癥狀，致殘率、病死率高。缺血區(qū)血管新生不足是缺血性疾病的主要病理改變，因此促進(jìn)血管新生、恢復(fù)血供是實(shí)現(xiàn)損傷修復(fù)的關(guān)鍵。

實(shí)驗(yàn)方法

小鼠下肢缺血模型的建立

4周齡雄性ApoE基因敲除小鼠84只和4周齡雄性C57野生小鼠42只，購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。觀察小鼠狀態(tài)良好后，ApoE基因敲除小鼠和C57野生小鼠，分別以高脂飲食和正常飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫21～22°Ｃ，濕度55％～65％，同時(shí)保持安靜通風(fēng)，所有小鼠自由食水，12h晝夜節(jié)律。喂養(yǎng)4周后，采用改良縮窄股動(dòng)脈法復(fù)制小鼠右下肢動(dòng)脈慢性缺血模型。

具體方法如下：在室溫（22℃）條件下，給予小鼠10％水合氯醛（3ml／kg）腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，用酒精消毒皮膚，并剪開(kāi)2～2.5cm的縱形切口。在大腿表面可看到一條紅色血管，循向上血管隱沒(méi)，在隱沒(méi)處剪開(kāi)1個(gè)小口，向下沿著血管剪開(kāi)1cm，根據(jù)血管走形再向上剪開(kāi)1.5cm。分離顯露游離股動(dòng)脈，4－0絲線結(jié)扎時(shí)連同7號(hào)細(xì)注射器系牢后抽出注射器針頭，縫合切口。C57野生小鼠只切開(kāi)并分離動(dòng)靜脈后縫合，不結(jié)扎縮窄，作為假手術(shù)組。ApoE基因敲除小鼠右下肢動(dòng)脈縮窄術(shù)后進(jìn)行激光多普勒血流測(cè)定，散光強(qiáng)度降低而不消失則造模成功。評(píng)價(jià)模型成功后，將ApoE基因敲除小鼠編號(hào)，隨機(jī)分為模型對(duì)照組和黑參煎劑組，每組42只。正品人參炮制后制成黑參，煎煮后濃縮，黑參煎劑組取0.5ml／次，每日灌胃1次，模型對(duì)照組和假手術(shù)組取0.9％氯化鈉溶液，0.5ml／次，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃14d。

下肢缺血癥狀觀察與評(píng)價(jià)

利用體式顯微鏡觀察小鼠后肢外觀（脫毛、趾甲增厚、壞死）評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分表示無(wú)壞死；1分表示1個(gè)腳趾壞死；2分表示2個(gè)或多個(gè)腳趾壞死；3分表示出現(xiàn)足壞死；4分表示下肢有壞死；5分表示是整個(gè)大腿自行離斷。注意并記錄周邊紅腫情況。

激光多普勒檢測(cè)小鼠缺血下肢血流灌

術(shù)前及術(shù)后即刻、7、14、21、28d行激光多普勒掃描，觀察小鼠下肢血流灌注情況。各組小鼠下肢缺血癥狀評(píng)分比較觀察發(fā)現(xiàn)，下肢缺血模型建立以后，小鼠右下肢出現(xiàn)無(wú)法站立、步態(tài)異常等行為表現(xiàn)。假手術(shù)組右下肢無(wú)任何異?，F(xiàn)象，模型對(duì)照組與黑參煎劑組右下肢足部出現(xiàn)不同程度發(fā)黑、壞死，其中黑參煎劑組的癥狀優(yōu)于模型對(duì)照組。各組小鼠右下肢缺血癥狀評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組與黑參煎劑組右下肢缺血癥狀評(píng)分均高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示下肢缺血模型構(gòu)建成功。與模型對(duì)照組相比，黑參煎劑組下肢缺血癥狀評(píng)分低。

高脂喂養(yǎng)的黑參煎劑組和模型對(duì)照組，右后肢動(dòng)脈結(jié)扎縮窄手術(shù)結(jié)束即進(jìn)行多普勒檢測(cè)，結(jié)果顯示術(shù)側(cè)基本無(wú)血流灌注，對(duì)側(cè)血流灌注良好，表明造模成功。術(shù)后即刻、7、14、21、28d進(jìn)行激光多普勒檢測(cè)，監(jiān)測(cè)小鼠右后肢血流變化情況，黑參煎劑組術(shù)后下肢血流恢復(fù)情況優(yōu)于模型對(duì)照組。

Fig1 各組小鼠右后肢激光多普勒掃描圖

采用下肢股動(dòng)脈結(jié)扎法構(gòu)建下肢缺血模型，可較好地模擬該類疾病患者下肢缺血的病理改變，呈現(xiàn)下肢缺血發(fā)生、演變及修復(fù)等多個(gè)過(guò)程。

近紅外組織血流灌注成像效果
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XR-X01型，新一代激光散斑血流成像儀，上海欣軟自主研發(fā)

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