經(jīng)國際權(quán)威學(xué)術(shù)刊物《自然》（Nature）邀請投稿，當(dāng)?shù)貢r間4月9日，來自中國的“抗新冠病毒攻關(guān)聯(lián)盟”正式發(fā)表了題為“Structure of Mpro from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors”的研究。該研究揭示了2.1?新冠病毒Mpro（又稱3CLpro）與 N3復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)，這也是世界上第一個被解析的新冠病毒蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)。

他們還分析探討了多種藥物發(fā)現(xiàn)策略，該研究為迅速開發(fā)具有臨床潛力的抗新冠肺炎的藥物奠定了重要基礎(chǔ)。通過計算機(jī)輔助藥物設(shè)計，攻關(guān)團(tuán)隊確定了新冠病毒主蛋白酶的強(qiáng)效抑制劑N3。此外，團(tuán)隊還進(jìn)行了10000多種化合物的篩選，發(fā)現(xiàn)了雙硫侖（disulfiram）、卡莫氟（carmofur）、依布硒（ebselen）、紫草素（shikonin）、Tideglusib和PX-12等多種對主蛋白酶有顯著抑制作用的藥物。

據(jù)中科院藥物所介紹，上述“抗新冠病毒攻關(guān)聯(lián)盟”由上?？萍即髮W(xué)-清華大學(xué)饒子和/楊海濤團(tuán)隊、中科院上海藥物所蔣華良團(tuán)隊、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院秦成峰團(tuán)隊以及中科院武漢病毒所石正麗團(tuán)隊、肖庚富團(tuán)隊等組成。國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（上海）主任兼上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授許文青、澳大利亞昆士蘭大學(xué)的Luke W. Guddat教授也參與了此項研究。

該項研究的通訊作者為上海藥物所研究員兼上海科技大學(xué)免疫化學(xué)研究所特聘教授蔣華良院士、清華大學(xué)教授兼上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所特聘教授饒子和院士、上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所課題組長楊海濤研究員（兼生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院副教授）。

新冠疫情在中國尚處于爬坡期的1月25日，中國科學(xué)院上海藥物研究所曾宣布：由蔣華良院士和饒子和院士領(lǐng)銜、20余個課題組參與的中國科學(xué)院上海藥物研究所和上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所抗新冠病毒感染聯(lián)合應(yīng)急攻關(guān)團(tuán)隊篩選出了30種具備治療潛力的藥物。隨后的1月26日，饒子和/楊海濤課題組測定的新冠病毒主蛋白酶（Mpro）的高分率晶體結(jié)構(gòu)對外公布，以便有更多的科技工作者、特別是從事藥物研發(fā)的科技人員使用。

新冠病毒是一種單鏈RNA正鏈包膜乙型冠狀病毒，入侵細(xì)胞后，新冠病毒會立即利用細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)合成自身復(fù)制必需的兩條超長復(fù)制酶多肽（pp1a和pp1ab）。這兩條復(fù)制酶多肽需要被剪切成多個零件（如RNA依賴的RNA聚合酶、解旋酶等等）；這些零件進(jìn)一步組裝成一臺龐大的復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)器，然后病毒才能啟動自身遺傳物質(zhì)的大量復(fù)制。

兩條復(fù)制酶多肽的剪切要求異常精確，因此病毒自身編碼了一把神奇的“魔剪”——主蛋白酶Mpro。Mpro在復(fù)制酶多肽上存在至少11個切割位點(diǎn)，只有當(dāng)這些位點(diǎn)被正常切割后，這些病毒復(fù)制相關(guān)的“零件”才能順利組裝成復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)器，啟動病毒的復(fù)制。

正是由于主蛋白酶在病毒復(fù)制過程中起到至關(guān)重要的作用，且人體中并無類似的蛋白質(zhì)，因此主蛋白酶就成為一個抗新冠病毒的關(guān)鍵藥靶，抑制這種酶的活性將有效阻止病毒復(fù)制。

值得一提的是，除了主蛋白酶Mpro，此次疫情期間，饒子和團(tuán)隊還領(lǐng)銜成功解析了新型冠狀病毒RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）的結(jié)構(gòu)，率先探討了廣受關(guān)注的抗病毒藥物瑞德西韋（GS-5734）治療新冠肺炎的病毒靶標(biāo)。其團(tuán)隊在SARS（嚴(yán)重急性呼吸綜合征）疫情暴發(fā)期間，就曾在世界上解析了首個SARS病毒蛋白質(zhì)（主要蛋白酶）的三維空間結(jié)構(gòu)。

全球首次解析新冠病毒“主蛋白酶-N3”三維空間結(jié)構(gòu)

研究團(tuán)隊通過質(zhì)譜法測定了COVID-19病毒Mpro的分子量為33797.0 Da，與其理論分子量33796.8 Da相符。

在此前的研究中，研究團(tuán)隊使用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計設(shè)計了邁克爾受體抑制劑N3，該抗體可以特異性抑制多種冠狀病毒主要蛋白酶，其中包括SARS-CoV（嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒）和MERS-CoV（中東呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒）的Mpro。

研究人員接下來構(gòu)建了新冠病毒Mpro的同源性模型，并使用分子對接來確定N3是否可以靶向這種新的冠狀病毒的Mpro。

研究人員發(fā)現(xiàn)，一個對接形態(tài)表明N3可以進(jìn)入底物結(jié)合口袋（the substrate-binding pocket），而這一“口袋”恰恰因為高度保守性而可以作為設(shè)計廣譜抑制劑的藥物靶標(biāo)。

（左）新冠病毒主蛋白酶-抑制劑N3的復(fù)合物結(jié)構(gòu)；（右）冠狀病毒主蛋白酶的底物結(jié)合口袋是一個保守藥物設(shè)計靶點(diǎn)

隨后，研究團(tuán)隊利用晶體衍射技術(shù)，獲得了分辨率為2.1埃的N3與Mpro復(fù)合物結(jié)構(gòu)。在新冠病毒主要蛋白酶結(jié)構(gòu)中，結(jié)構(gòu)域I和結(jié)構(gòu)域II形成六鏈反平行β-桶形結(jié)構(gòu)，在它們之間的裂縫中帶有底物結(jié)合位點(diǎn)，即藥物靶標(biāo)“口袋”。

值得注意的是，早在1月26日，研究團(tuán)隊測定的Mpro高分率晶體結(jié)構(gòu)已在PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank, PDB）上公開。自1月26日起，團(tuán)隊已為國內(nèi)外300多家高校、研究機(jī)構(gòu)及企業(yè)的實(shí)驗室直接提供了數(shù)據(jù)。該結(jié)構(gòu)也被PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫選為2020年2月的明星分子（February Molecule of the Month）。

事實(shí)上，隨著新冠疫情在全球暴發(fā)，科學(xué)家們一直在努力尋找有效的病毒抑制劑。此前3月20日，《科學(xué)》（Science）雜志發(fā)表了德國呂貝克大學(xué)生物化學(xué)研究所Rolf Hilgenfeld等人的研究，他們通過對新冠病毒主要蛋白酶結(jié)構(gòu)的解析，對此前的抑制劑進(jìn)行了優(yōu)化，并認(rèn)為一種名為13b的α-酮酰胺抑制劑顯示出明顯的肺向性，并且適用于通過吸入途徑給藥。

多種策略篩選潛在藥物：依布硒和N3均能在細(xì)胞水平顯著抑制新冠病毒復(fù)制

目前，對于新冠病毒的治療還沒有特效藥物。為了快速發(fā)現(xiàn)具有臨床潛力的抗病毒化合物，研究團(tuán)隊還開發(fā)了一種結(jié)合從頭設(shè)計、虛擬藥物篩選和高通量篩選的策略，以確定現(xiàn)有藥物是否能靶向COVID-19病毒的Mpro。

與N3結(jié)合的新冠病毒Mpro復(fù)合物結(jié)構(gòu)對于通過計算機(jī)篩選來鑒定潛在靶向藥物提供了一種模型，研究人員進(jìn)而建立了潛在結(jié)合化合物的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫。

結(jié)果表明，肉桂硫胺（cinanserin）能夠與底物結(jié)合口袋緊密結(jié)合，對Mpro的IC50（半抑制濃度）值為125μM。

肉桂硫胺是一種血清胺拮抗制劑，在1960年代已在人體中進(jìn)行了初步臨床測試，并且先前已顯示出抑制SARS-CoV的Mpro的作用。肉桂硫胺在上世紀(jì)70年代用于治療精神分裂癥，對冠狀病毒3CL水解酶具有抑制作用。

團(tuán)隊認(rèn)為，它具有作為抗新冠病毒藥物的優(yōu)化潛力。為了表征其酶促活性并進(jìn)行抑制劑的高通量篩選，研究團(tuán)隊開發(fā)了一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）分析方法。

接下來，攻關(guān)“聯(lián)盟”繼續(xù)聯(lián)合利用虛擬篩選和高通量篩選策略相結(jié)合的方式，對10000多個老藥、臨床藥物以及天然活性產(chǎn)物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了數(shù)種對主蛋白酶有顯著抑制作用的先導(dǎo)藥物，其中包括雙硫侖（disulfiram）、卡莫氟（carmofur）、依布硒（ebselen）、紫草素（shikonin）、Tideglusib和PX-12等。

其中，依布硒對于新冠病毒Mpro的抑制作用最強(qiáng)。值得一提的是，依布硒已用于治療聽力障礙等多種疾病的臨床試驗（完成臨床二期），并具有很好的安全性表現(xiàn)。

為了進(jìn)一步證實(shí)它們體外的酶促抑制結(jié)果，研究人員進(jìn)行了后續(xù)的抗新冠病毒實(shí)驗，結(jié)果表明，依布硒和N3均能在細(xì)胞水平顯著抑制新冠病毒的復(fù)制。

攻關(guān)團(tuán)隊表示，“在這一研究中，基于結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計、計算機(jī)虛擬篩選和高通量篩選三種研究策略的結(jié)合被證明是找到針對抗新冠病毒藥物的有效策略?！?/p>

研究者們認(rèn)為，這種篩選策略有效性較高，可以快速發(fā)現(xiàn)具有臨床潛力的藥物，以應(yīng)對尚無特定藥物或疫苗的新傳染病。