北京時間5月18日晚間，頂級學術(shù)期刊《自然-方法學》（Nature Methods）在線發(fā)表了來自中國農(nóng)科院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所、中科院上海生命科學研究院神經(jīng)科學研究所、中科院計算生物學研究所、上海交通大學、上?？萍即髮W、復(fù)旦大學等團隊的一項研究，題為“A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target effects”。

研究團隊根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測了基因編輯過程中決定脫靶的重要氨基酸，并在不影響催化活性的情況下突變相應(yīng)的氨基酸，最終得到了顯著減低基因編輯脫靶效應(yīng)的單堿基編輯工具。

這篇論文的通訊作者為中國農(nóng)科院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所研究員、研究組長左二偉，中科院神經(jīng)科學研究所研究員、靈長類疾病模型研究組組長楊輝，中科院計算生物學研究所（中國科學院-馬普學會計算生物學研究所）研究員李亦學。左二偉同時為第一作者。

CRISPR/Cas9是廣泛關(guān)注的新一代基因編輯工具，自從2012年被發(fā)明以來備受外界期待。而單堿基編輯技術(shù)是CRISPR/Cas9的衍生工具，該技術(shù)可以在不切斷DNA雙鏈的情況下實現(xiàn)單核苷酸的定向突變，為治療單堿基突變引起的遺傳性疾病帶來了希望。

目前已知的人類致病遺傳變異中，約58%都屬于點突變，而約15%的致病點突變都屬于T·A--C·G變異。2016年，美國博德研究所、哈佛大學的David Liu的實驗室開發(fā)出新型單堿基編輯器CEB（Cytosine Base Editor）。

但從2019年開始，單堿基編輯工具的安全性受到了質(zhì)疑。楊輝、美國麻省總醫(yī)院J. Keith Joung等國內(nèi)外多個研究團隊此前發(fā)文報道了單堿基編輯器存在嚴重的DNA和RNA脫靶效應(yīng)，該效應(yīng)可能會引起包括癌癥在內(nèi)的多種非預(yù)期的副作用。與此同時，國內(nèi)外多位科學家通過多種方式研究降低基因編輯DNA和RNA脫靶的方法，取得了一定進展，但也存在一定局限。

目前最廣泛使用的堿基編輯用的是大鼠APOBEC1（rAPOBEC1）酶，該酶誘導(dǎo)DNA胞嘧啶（C）脫氨，該系統(tǒng)由連接的Cas蛋白、指導(dǎo)RNA（gRNA）、rAPOBEC1組成。在此次研究中，左二偉、楊輝等人使用研究團隊此前開發(fā)的新型脫靶檢測技術(shù)GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）和RNA-Seq同時檢測了CEB突變體的DNA脫靶和RNA脫靶。他們同時也發(fā)現(xiàn)，DNA和RNA的脫靶是互相獨立的，需要同時檢測。

研究團隊描述了23個合理設(shè)計的CBE突變體的篩選，揭示了在預(yù)測DNA結(jié)合位點上的突變氨基酸可以顯著降低Cas-9脫靶效應(yīng)。

此外，他們還獲得了一個CBE突變體YE1-BE3-FNLS。研究團隊認為，他們獲得的 YE1-BE3-FNLS是高精度、高活性單堿基編輯工具，顯著降低了脫靶效應(yīng)并提高了編輯效率，有望應(yīng)用于遺傳疾病基因治療，推動基因編輯臨床化應(yīng)用。

據(jù)介紹，GOTI是左二偉、楊輝等團隊合作建立的全新一代基因編輯脫靶檢測技術(shù)，該技術(shù)在靈敏性、準確性和適用范圍上遠超之前的脫靶檢測技術(shù)，該研究成果于2019年3月發(fā)表于《科學》（Science）。研究團隊隨后基于GOTI深入探索解決單堿基編輯器脫靶效應(yīng)的方法，此次研究成果是這一系列研究中取得的研究進展之一。

值得一提的是，此前的2月10日，David Liu也在國際學術(shù)期刊《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）提出了一種方案。他們篩選不同CBE在大腸桿菌和人細胞中誘導(dǎo)Cas9非依賴的脫氨傾向，找到了降低Cas9非依賴型DNA脫靶風險的關(guān)鍵，并通過蛋白質(zhì)工程等策略構(gòu)建出一系列低脫靶風險的高活性CBE系統(tǒng)，其中YE1-BE4在保持較高的編輯效率的同時降低了DNA和RNA上的脫靶，并且同時縮小了編輯窗口。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-0832-x