自然光下的小鼠與遠(yuǎn)紅光下的小鼠  本文圖均為 受訪(fǎng)者 供圖

繼7月10日在Science Advances 上發(fā)表遠(yuǎn)紅光調(diào)控的分割型split-Cas9基因編輯系統(tǒng)后，7月24日，華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、華東師范大學(xué)醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)研究中心葉海峰研究員團(tuán)隊(duì)在學(xué)術(shù)期刊Nature Communications上發(fā)表最新研究成果——利用光遺傳學(xué)與合成生物學(xué)理念設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一套遠(yuǎn)紅光調(diào)控的分割型Cre-loxP重組酶系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱(chēng)FISC系統(tǒng))。

Cre-loxP重組酶系統(tǒng)是一種位點(diǎn)特異的基因重組技術(shù)，可以迅速而有效地實(shí)現(xiàn)各種生理環(huán)境下的基因定點(diǎn)插入、刪除、替換和倒位等操作，在擬南芥、水稻、果蠅、斑馬魚(yú)、小鼠等多種高等真核生物體內(nèi)均被廣泛應(yīng)用。

該研究成果是繼遠(yuǎn)紅光控制細(xì)胞命運(yùn)、遠(yuǎn)紅光控制基因編輯之后，又一重要應(yīng)用，拓寬了光遺傳學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域。

傳統(tǒng)的Cre-loxP重組酶系統(tǒng)存在早期胚胎致死和長(zhǎng)期表達(dá)的毒性問(wèn)題。

為了解決毒性、組織穿透性差等問(wèn)題，華東師范大學(xué)的研究人員以低強(qiáng)度的遠(yuǎn)紅光外部照射作為控制手段（730nm，LED光源），實(shí)現(xiàn)了非侵入性、安全有效遠(yuǎn)程無(wú)痕控制。

在課題組多年的研究經(jīng)驗(yàn)和積累之上，研究團(tuán)隊(duì)將Cre重組酶分成CreN59和CreC60兩部分，它們?cè)贒ocS與Coh2蛋白自發(fā)相互作用下，重新形成有功能的完整Cre重組酶，進(jìn)而識(shí)別報(bào)告基因中l(wèi)oxP位點(diǎn)，切除阻止基因表達(dá)的STOP序列，從而啟動(dòng)目的基因表達(dá)。而CreC60與DocS融合蛋白，被遠(yuǎn)紅光誘導(dǎo)表達(dá)。

 FISC系統(tǒng)工作原理

按照預(yù)期設(shè)計(jì)系統(tǒng)元件后，研究團(tuán)隊(duì)人員在人胚胎腎細(xì)胞HEK-293中進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)結(jié)果并不理想，在黑暗條件下的背景過(guò)高。如何進(jìn)一步降低本底的泄露至關(guān)重要。研究團(tuán)隊(duì)人員通過(guò)優(yōu)化不同啟動(dòng)子，不同質(zhì)粒量，蛋白間連接肽以及不同Cre重組酶作用序列，終于獲得了最優(yōu)版本的FISC系統(tǒng)。

為了將該系統(tǒng)進(jìn)一步用于臨床治療，研究團(tuán)隊(duì)利用AAV病毒將FISC系統(tǒng)遞送到轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠體內(nèi)。通過(guò)觀察小鼠活體成像和肝臟成像發(fā)現(xiàn)，與黑暗組小鼠相比，光照組小鼠的熒光蛋白表達(dá)量更高。這充分說(shuō)明，利用AAV載體，成功實(shí)現(xiàn)了FISC系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)的高效DNA重組。

研究人員表示，F(xiàn)ISC系統(tǒng)成功在體內(nèi)外實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)可控的基因改造，具有非侵入性、低毒性以及空間特異性。

該論文的通訊作者為華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院葉海峰研究員。2017級(jí)博士研究生吳嘉麗、王美艷副研究員和已畢業(yè)2018屆碩士研究生楊雪平為該研究論文的共同第一作者。  

研究團(tuán)隊(duì)介紹，本研究是葉海峰課題組在光遺傳學(xué)應(yīng)用上的進(jìn)一步的研究成果。2017年，該課題組開(kāi)發(fā)遠(yuǎn)紅光調(diào)控的轉(zhuǎn)基因表達(dá)控制系統(tǒng)，并實(shí)現(xiàn)了智能手機(jī)遠(yuǎn)程控制細(xì)胞釋放胰島素治療糖尿病的目標(biāo)。2018年，該課題組在美國(guó)科學(xué)院院刊PNAS上報(bào)道了遠(yuǎn)紅光調(diào)控的CRISPR-dCas9內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄激活裝置（FACE），可實(shí)現(xiàn)表觀遺傳操控以及誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為功能性神經(jīng)細(xì)胞。2020年，該課題組在Science Advances 上報(bào)道了一個(gè)遠(yuǎn)紅光調(diào)控的分割型split-Cas9基因編輯系統(tǒng)（FAST），通過(guò)對(duì)小鼠腫瘤中的致癌基因進(jìn)行編輯，成果實(shí)現(xiàn)了光控抑制腫瘤生長(zhǎng)。